हम ऑप्टिकल सेंसर पन्नी के साथ 2D O2 वितरण मानचित्रण के लिए एक उपन्यास, आवृत्ति-डोमेन ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा के उपयोग का वर्णन करते हैं। जलीय पौधों के राइजोस्फीयर में ओ2 माइक्रोएनवायरमेंट की कल्पना करने के लिए सेंसर पन्नियों की तैयारी, अंशांकन और अनुप्रयोग के साथ कैमरा सिस्टम और छवि विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है।
हम 2D में उच्च स्थानिक (< 50-100 μm) और लौकिक (< 10 s) संकल्प पर छवि भंग ऑक्सीजन (O2)की एक विधि का वर्णन करते हैं । विधि आवृत्ति-डोमेन में ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग के लिए एक विशेष कैमरा सिस्टम के संयोजन में ओ2 संवेदनशील ल्यूमिनेसेंट सेंसर पन्नी (प्लैनार ऑप्टोड्स) को नियोजित करती है। प्लैपर ऑप्टोड्स को एक बहुलक में ओ2-संवेदनशीलसंकेतक रंगे को भंग करके और चाकू कोटिंग के माध्यम से एक परिभाषित मोटाई में ठोस समर्थन पर मिश्रण फैलाकर तैयार किया जाता है। सॉल्वेंट के वाष्पीकरण के बाद, प्लानर ऑप्टोड को ब्याज के नमूने के साथ निकट संपर्क में रखा जाता है – यहां जलीय पौधे लिटोरेला यूनिफ्लोराकी जड़ों के साथ प्रदर्शन किया गया। प्लैनार ऑप्टोड के भीतर संकेतक रंग के ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल में ओ2 एकाग्रता-निर्भर परिवर्तन एक विशेष कैमरे का उपयोग करपारदर्शी वाहक पन्नी और मछलीघर दीवार की पीठ के माध्यम से चित्रित किया गया है। यह कैमरा एक संग्राहक उत्तेजना संकेत और उत्सर्जन संकेत के बीच चरण कोण में बदलाव के माध्यम से ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम (μs) को मापता है। यह विधि ल्यूमिनेसेंस तीव्रता इमेजिंग विधियों से बेहतर है, क्योंकि संकेत उत्तेजित स्रोत की रंग एकाग्रता या तीव्रता से स्वतंत्र है, और पूरी तरह से ल्यूमिनेसेंस क्षय समय पर निर्भर करता है, जो एक आंतरिक रूप से संदर्भित पैरामीटर है। नतीजतन, एक अतिरिक्त संदर्भ रंग या संदर्भ के अन्य साधनों की जरूरत नहीं है। हम पौधे राइजोस्फीयर के स्थूल ओ2 इमेजिंग के लिए प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं, लेकिन कैमरा सिस्टम को आसानी से माइक्रोस्कोप से जोड़ा जा सकता है।
तलछट और मिट्टी में घुली हुई गैसों और आयनों का वितरण और गतिशीलता बायोजियोकेमिकल प्रक्रियाओं जैसे माइक्रोबियल श्वसन1,2,या पौधों की जड़ों से रेडियल ऑक्सीजन हानि3,4,5और रोगाणुओं के रासायनिक सूक्ष्म वातावरण6,7,संयंत्र राइजोस्फीयर5,8,9 और पशु बिल10, 11,12. इस तरह के प्रसार-सीमित वातावरण में जैविक और रासायनिक गतिविधि रासायनिक सब्सट्रेट्स या बायोजियोकेमिकल प्रक्रियाओं के उत्पादों के भारी ढाल बना सकती है। विशेष रूप से, ओ2 उपलब्धता का बायोजियोकेमिकल प्रक्रियाओं पर बहुत बड़ा प्रभाव पड़ता है और इस प्रकारसिस्टम 13के जीव विज्ञान और पारिस्थितिकी का। इसलिए, उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर ओ2 सांद्रता का विश्लेषण जलीय और स्थलीय विज्ञान में प्रमुख महत्व का है । सबसे पहले, इस महत्वपूर्ण एनालाइट को मापने के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल और ऑप्टिकल माइक्रोसेंसर14,15 विकसित किए गए थे। बाद में, प्लैपर ऑप्टोड्स के साथ ओ2 की 2 आयामी (2डी) इमेजिंग12,16,17,18,19पेश की गई, जिसने मिट्टी और तलछट में विषम ओ2 वितरण के दृश्य और मात्राकोनीकरण को सक्षम किया।
प्लानर ओ2 ऑप्टोड्स में ओ2-सेंसिटिव इंडिकेटर डाइ20होता है, जो एक उपयुक्त बहुलक21में भंग हो जाता है । संकेतक रंग विशिष्ट ऑप्टिकल तरंगदैर्ध्य पर उत्साहित है और ल्यूमिनेसेंस के रूप में विश्राम पर लाल-स्थानांतरित प्रकाश उत्सर्जित करता है। ओ2की उपस्थिति में, उत्तेजित संकेतक रंग टक्कर पर ओ2 अणु के लिए अपनी ऊर्जा स्थानांतरित कर सकते हैं, जिसे टकराव आधारित ल्यूमिनेसेंस शमन22के रूप में जाना जाता है। इसलिए, ल्यूमिनेसेंस तीव्रता के साथ-साथ ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल23में वृद्धि के साथ कम हो जाता है। एक आदर्श मामले में तीव्रता और जीवनकाल में परिवर्तन स्टर्न-वोल्मर समीकरण (समीकरण 1) का पालन करता है या तो अनुपस्थिति में चमक तीव्रता या जीवनकाल का उपयोग कर (मैं0;α0)या उपस्थिति (I, α) ओ2 की एक दी गई एकाग्रता[क्यू]पर । स्टर्न-वोल्मर स्थिर (Ksv)ओ2के प्रति ऑप्टोड की संवेदनशीलता के लिए एक उपाय है; कश्मीरएसवी तापमान और दबाव जैसे पर्यावरणीय चरों पर निर्भर है।
(1)
एक कैमरा सिस्टम के साथ एक प्लानर सेंसर पन्नी पर ल्यूमिनेसेंस में इस तरह के परिवर्तनरिकॉर्डिंग O2 वितरण में इसी परिवर्तन की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रारंभ में, सरल ल्यूमिनेसेंस तीव्रता आधारित ओ2 इमेजिंग का उपयोग18किया गया था। हालांकि, ऐसी कार्यप्रणाली बाहरी हस्तक्षेपों के प्रति बहुत संवेदनशील है, जो विषम रोशनी, उत्तेजना स्रोत या कैमरे में उतार-चढ़ाव के साथ-साथ प्लैपर ऑप्टोड के भीतर संकेतक रंगे का असमान वितरण के कारण परिणामों की विश्वसनीयता से समझौता करती है।
इनमें से कुछ सीमाओं को रेशियोमेट्रिक इमेजिंग17,24के लिए प्लानर ऑप्टोड्स का उपयोग करके समाप्त किया जा सकता है, जहां ओ2-संवेदनशीलसंकेतक डाइ को ओ2-संकेतककी तुलना में एक अलग स्पेक्ट्रल रेंज में एक असंवेदनशील संदर्भ रंगभेद के साथ प्लानर ऑप्टोड की बहुलक परत में सह-स्थिर किया जाता है। दो स्पेक्ट्रल खिड़कियों में प्राप्त उत्सर्जन छवियों के आधार पर, ओ2-संवेदनशील उत्सर्जन संकेत संदर्भ संकेत द्वारा विभाजित किया गया है, एक अनुपात छवि उत्पन्न करता है जो उपरोक्त हस्तक्षेप5,17से कम प्रवण होता है। विधि के लिए एक दूसरे रंग के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिसे आदर्श रूप से एक ही उत्तेजना स्रोत से उत्साहित किया जा सकता है, लेकिन कैमरे की एक और स्पेक्ट्रल खिड़की (जैसे, आरजीबी कैमरे के एक अन्य रंग चैनल में) में एक अलग तरंगदैर्ध्य (महत्वपूर्ण स्पेक्ट्रल ओवरलैप के बिना) में उत्सर्जित होता है।
वैकल्पिक रूप से, ओ2 इमेजिंग संकेतक रंग के ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल में ओ2-निर्भरपरिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने पर आधारित हो सकती है, जो संकेतक एकाग्रता25में असमान रोशनी या विषमताओं से प्रभावित नहीं होती है। पहले ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम-आधारित ओ2 इमेजिंग सिस्टम एक गेट-सक्षम चार्ज्ड डिवाइस (सीसीडी) कैमरा सिस्टम26के साथ समय-डोमेन मापन पर आधारित थे, जहां एक स्पंदित उत्तेजना स्रोत का उपयोग किया जाता है और ल्यूमिनेसेंस छवियों को संकेतक8,23,27के उत्तेजना या उत्सर्जन के भीतर परिभाषित समय अंतराल पर लिया जाता है। ऐसी छवियों से, ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल को अंशांकन में इसी ओ2 एकाग्रता से निर्धारित और सहसंबद्ध किया जा सकता है। बाद में, प्लानर ऑप्टोड के खिलाफ दबाए गए दिए गए नमूने के लिए ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम छवियों को ओ2 एकाग्रता के इसी 2डी वितरण की छवियों में परिवर्तित किया जा सकता है। इस प्रणाली का उपयोग प्रयोगशाला और सीटू16,28दोनों में कई अनुप्रयोगों में किया गया है, लेकिन आवश्यक गेट-सक्षम सीसीडी कैमरा अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है।
हाल ही में, एक अलग ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा सिस्टम जारी किया गया था, जो आवृत्ति-डोमेन8में छवियों का अधिग्रहण करता है। सिस्टम उत्तेजना के लिए लगातार संग्राहक प्रकाश स्रोत पर निर्भर करता है। यह या तो एक स्पंदित उत्तेजना के बजाय एक सिनसोइडल या वर्ग तरंग हो सकती है, जिसका उपयोग समय-डोमेन में छवि अधिग्रहण के लिए किया जाता है। इस मॉड्यूलेशन के परिणामस्वरूप ओ2 संकेतक रंग े की एक संग्राहक ल्यूमिनेसेंस उत्सर्जन होता है, जो एक कोण द्वारा चरण-स्थानांतरित होता है, जो संकेतक रंग (α α) (समीकरण 2 देखें) के ल्यूमिनेसेंस जीवनकाल पर निर्भर करता है।
(2)
उत्तेजना और उत्सर्जन आयाम (यानी, तथाकथित मॉड्यूलेशन इंडेक्स या गहराई (निरंतर ल्यूमिनेसेंस भाग द्वारा विभाजित आयाम)) के बीच परिवर्तन भी पागलपन जीवनकाल पर निर्भर है। इसलिए, एक ज्ञात मॉड्यूलेशन आवृत्ति स्थापित करके कैमरे के भीतर विशेष सीएमओएस छवि सेंसर एनएस में ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम को मापने में सक्षम है, जैसा कि कहींऔर विस्तार से वर्णितहै। ऑपरेशन सिद्धांत पर एक सामान्य गाइड पाया जा सकता है (निम्नलिखितलिंक https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8 का उपयोग करना)।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम 2D9,31में जलीय मीठे पानी के पौधे लिटोरेला यूनिफ्लोरा की जड़ों के चारों ओर ओ2 एकाग्रता के वितरण को इमेजिंग करने के लिए उपन्यास कैमरा सिस्टम के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं। हम इस बात पर जोर देना चाहेंगे कि यह विधि इस आवेदन तक सीमित नहीं है। ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील ऑप्टोड्स या सेंसर कण27 का उपयोग चिकित्सा अनुसंधान32में किया गया है, बायोप्रिंटिंग33में, दबाव संवेदनशील पेंट34,35के लिए, या फोटोसिंथेटिक सिस्टम का अध्ययन करने के लिए2,36,37,बस आवेदन के कुछ अन्य क्षेत्रों का नाम लेने के लिए।
इस प्रोटोकॉल में, ऑप्टोड तैयारी से ओ2 छवि विश्लेषण तक पूरे कार्य-प्रवाह को कवर किया गया है। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, रासायनिक छवियों को उपन्यास आवृत्ति-डोमेन-आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। आवेदन के आधार पर, प्लानर ऑप्टोड्स को विभिन्न आकारों और सेंसर परत की परत मोटाई में गढ़ा जा सकता है, जो मजबूत 50-100 माइक्रोन मोटी प्लैनर ऑप्टोडेस से लेकर वर्ग सेंटीमीटर के कई दसवें हिस्से के माइक्रोस्कोप कवर स्लिप के साथ माइक्रोस्कोप कवर स्लिप6,40तक हो सकता है। इस विधि की क्षमता को एक विशेष अनुप्रयोग के साथ प्रदर्शित किया गया था, बल्कि न केवल12,28संयंत्र राइजोस्फीयर में ओ2 इमेजिंग तक सीमित है।
शुद्ध ल्यूमिनेसेंस तीव्रता-आधारित रासायनिक इमेजिंग विधियों की तुलना में इस विधि के कई लाभ हैं। ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग असमान रोशनी, असमान ऑप्टोड मोटाई और फोटो ब्लीचिंग25से प्रभावित नहीं है। इसके अलावा, यह विधि रेशियोमेट्रिक इमेजिंग17,37में एक अतिरिक्त संदर्भ रंगके के उपयोग से बचती है। अन्य लाइफटाइम आधारित कैमरा सिस्टम की तुलना में, जैसे आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले गेटेड टाइम-डोमेन कैमरे8,26,उपन्यास कैमरा सिस्टम और यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल तुलनीय परिणाम दे सकते हैं। हाल ही में एक प्रकाशन में, उन दो प्रणालियों की विश्लेषणात्मक विशेषताओं की तुलना की गई थी और यह पाया गया कि आवृत्ति-डोमेन आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम कैमरा सिस्टम कम से कम बंद समय-डोमेन आधारित पूर्ववर्ती8के बराबर है।
हमने सबसे सरल ओ2 ऑप्टोड प्रस्तुत किया है जिसमें केवल बहुलक मैट्रिक्स में एक संकेतक शामिल है। कई अन्य संभावित ओ 2 संकेतकोंके अलावा जिनका उपयोग किया जा सकता है,20 को शामिल किया जा सकता है, यानी, ऑप्टोड की पारदर्शिता को कम करते हुए सेंसर सिग्नल बढ़ाने के लिए टीओ2 या डायमंड पाउडर2 जैसे बिखरने वाले एजेंटों को शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा अतिरिक्त रंगों का उपयोग ऊर्जा हस्तांतरण41के माध्यम से सिग्नल तीव्रता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।
प्लानर ऑप्टोड फैब्रिकेशन के लिए, हम वर्णित सेंसर कॉकटेल संरचना का उपयोग करते समय सॉल्वेंट वाष्पीकरण (उपयोग किए गए अंतर का लगभग 10%) के बाद लगभग 7.5 से 12 माइक्रोन की अंतिम सेंसर परत मोटाई पैदा करने के लिए 75 – 120 माइक्रोन के चाकू-कोटिंग डिवाइस में अंतर का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह संकेत तीव्रता के बीच एक अच्छा समझौता है, जिसे उच्च रंग लोडिंग द्वारा संशोधित किया जा सकता है, या उच्च चमक के संकेतक और संदर्भ रंगों और प्रतिक्रिया समय का चयन करके। परत की मोटाई में वृद्धि के परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया समय में वृद्धि होती है, क्योंकि एनालिएट के लिए आसपास के मीडिया के साथ संवेदन परत में थर्मोडायनामिक संतुलन तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय अवधि12बढ़ जाती है।
ऑप्टोड्स, जैसा कि यहां वर्णित है, ओ2 एकाग्रता में कुछ सेकंड17 के भीतर परिवर्तन ों पर प्रतिक्रिया करते हैं, जबकि अभी भी पर्याप्त रूप से मजबूत ल्यूमिनेसेंस संकेत हैं। सब-सेकंड रिस्पांस टाइम के साथ अल्ट्राथिन सेंसर कोटिंग्स स्पिन-कोटिंग6के साथ महसूस की जा सकती हैं । यदि समर्थन या चाकू-कोटिंग डिवाइस अच्छी तरह से साफ नहीं हैं, तो इसके परिणामस्वरूप असंगत सेंसर परतें हो सकती हैं। इसके अलावा, जब कॉकटेल पूरी तरह से समरूप नहीं है या कोटिंग डिवाइस के सामने फैलने के बाद बहुत तेजी से लागू होता है तो इस तरह के एक अवांछित परिणाम को देखा जा सकता है। इसलिए, इष्टतम ऑप्टोड्स तैयार करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है।
विधि का उपयोग नमूनों को छवि देने के लिए किया जा सकता है जिसे ऑप्टोड के निकट संपर्क में रखा जा सकता है, जैसे कि कुछ समुद्री जानवर42,बायोफिल्म6 और मिट्टी31 सिर्फ कुछ नाम के लिए। हम एक उद्देश्य का उपयोग करके एक स्टैंडअलोन सेटअप पेश करते हैं, हालांकि, कैमरे को आसानी से उच्च रिज़ॉल्यूशन केमिकल इमेजिंग43के लिए माइक्रोस्कोप पर जोड़ा जा सकता है।
जबकि समय-डोमेन आधारित ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग ने पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस26का दमन सक्षम किया, यह नई आवृत्ति-डोमेन-आधारित कैमरा सिस्टम8का उपयोग करते समय एक मुद्दा है। निरंतर छवि अधिग्रहण के कारण, यह कैमरा नमूने की किसी भी पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को रिकॉर्ड करेगा जो चयनित एलईडी से उत्साहित हो सकता है और चयनित स्पेक्ट्रल विंडो में उत्सर्जित करता है जैसा कि कैमरा उद्देश्य पर उत्सर्जन फिल्टर द्वारा परिभाषित किया गया है। यह एक जाहिरा तौर पर कम जीवनकाल में परिणाम होगा और फलस्वरूप झूठी रीडिंग में । यदि आप ओ2 सेंसर उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ एक महत्वपूर्ण आंतरिक फ्लोरेसेंस ओवरलैपिंग के साथ नमूनों के साथ काम करते हैं, तो कार्बन ब्लैक2,17युक्त एक अतिरिक्त परत कोटिंग करके ऑप्टोड के शीर्ष पर एक अतिरिक्त ऑप्टिकल अलगाव लागू करना आवश्यक है। इस प्रकार, केवल प्लानर ऑप्टोड से उत्सर्जित ल्यूमिनेसेंस कैमरे तक पहुंच जाएगा। पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस की जांच करने के लिए ऑप्टोड के बिना एक छवि ली जा सकती है, जो तब विशेष रूप से नमूने की आंतरिक चिकनाई दिखाएगी। संकेतक रंगे की ल्यूमिनेसेंस तीव्रता को बढ़ाने के लिए सेंसर कॉकटेल में टीआईओ2 या डायमंड पाउडर2,44जैसे बिखरने वाले एजेंटों को जोड़ना भी संभव है। हालांकि, यह तेजी से फोटो ब्लीचिंग का कारण भी बन सकता है और टीओ2 एक ज्ञात फोटो उत्प्रेरक है, जो एक रंग41की फोटोस्थिरता को ख़राब कर सकता है। एक और पहलू पर विचार करने के लिए पृष्ठभूमि प्रकाश है । जब कल्पना चिकनाई जीवन काल, पृष्ठभूमि प्रकाश के रूप में कुशलता से संभव के रूप में बचा जाना चाहिए । इसलिए, इस इमेजिंग विधि के लिए सेटअप को अंधेरे वातावरण में रखने की आवश्यकता होती है और छवि अधिग्रहण के दौरान किसी भी बाहरी प्रकाश स्रोत को अस्थायी रूप से बंद करने की आवश्यकता होती है।
सारांश में, ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग एक मजबूत रासायनिक इमेजिंग विधि है जिसे कई अलग-अलग अनुप्रयोगों के अनुकूल किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल (अनुभाग 1 -5 देखें) ओ2 छवि उत्पन्न करने के लिए सभी आवश्यक चरणों को कवर करता है और वर्तमान में सबसे लचीला आवृत्ति-डोमेन ल्यूमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करता है, जो प्लैपर ऑप्टोड्स के साथ 2डी ओ2 इमेजिंग के लिए बंद गेटेड टाइम-डोमेन कैमरा को बदल सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सहायता के लिए सोफी लिंडेगार्ड जैकबसेन (कोपेनहेगन विश्वविद्यालय) और लार्स बोरेगार्ड पेडरसन (आरोहस विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करते हैं । इस अध्ययन के लिए वित्तपोषण स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क (DFF-1323-00065B) से एक Sapere-Aude उन्नत अनुदान से प्राप्त किया गया था; एमके), स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क से परियोजना अनुदान । प्राकृतिक विज्ञान (DFF-8021-00308B; एमके) और तकनीकी और उत्पादन विज्ञान (DFF-8022-00301B और DFF-4184-00515B; एमके), डेनिश नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (DNRF136), और Poul कारण जेंसेन फाउंडेशन (केके) ।
Air pump with air stone and water pump | Local aquarium store | ||
Chloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
DC4 silicone compound | Dow Corning GmbH | 2793695 | |
Gas mixer | Vögtlin Instruments GmbH | red-y compact meter GCM | This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices |
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ImageJ Software | ImageJ | Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html) | |
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2021 | This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation. |
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pco.flim | PCO AG, Germany | Frequency domain based luminescence lifetime camera | |
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) | Frontier Scientific | PtT975 | O2 indicator |
polyethylene terephthalate (PET) foil | Goodfellow | 320-992-72 | Such foils might also be found from other providers and serve as solid support |
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