从新鲜冷冻的小鼠骨骼中产生高质量RNA的激光捕获微解剖协议
Summary
开发了激光捕获微分体（LCM）协议，以获得足够数量的高质量RNA，用于骨细胞的基因表达分析。目前的研究集中在小鼠股骨部分。然而，这里报道的LCM协议可用于研究任何硬组织细胞的基因表达。
Abstract
RNA的产生和完整性对RNA分析起决定性作用。然而，在整个激光捕获微解剖（LCM）过程中，保持RNA完整性往往在技术上具有挑战性。由于LCM研究对低含量材料起作用，因此对RNA产量有限的担忧也很重要。因此，开发了一种LCM协议，以获得足够数量的高质量RNA，用于骨细胞的基因表达分析。评估了染色方案、冷冻切片厚度、微解剖组织数量、RNA提取试剂盒和LCM系统对从微解剖骨细胞中获得的RNA产量和完整性的影响。八微米厚的冷冻骨部分使用胶膜制成，并使用商业LCM染色的快速协议进行染色。样品夹在聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）膜和粘合膜之间。利用重力采集样品和基于柱的RNA提取方法获得足够产量的高质量RNA的LCM系统。目前的研究集中在小鼠股骨部分。然而，这里报道的LCM协议可用于研究任何硬组织细胞在生理条件和疾病过程中的原位基因表达。
Introduction
组织由异构和空间分布的细胞类型组成。给定组织中的不同细胞类型对同一信号的反应可能不同。因此，能够分离特定的细胞群，以评估不同细胞类型在生理和病理条件下的作用是至关重要的。激光捕获微解剖（LCM）提供了一种相对快速和精确的方法，用于从复杂组织1中分离和去除指定的细胞。LCM 系统使用激光束的力量将感兴趣的细胞与组织组织部分分离，而无需酶处理或培养生长。这意味着细胞处于其自然组织栖息地，并且组织架构，包括不同细胞之间的空间关系被保留。捕获的细胞和残余组织的形态保存完好，可以从同一张幻灯片按顺序取样几个组织成分。分离的细胞随后可用于对其RNA、DNA、蛋白质或代谢物含量2、3的后续分析。
为了分析不同细胞群的基因表达，或经过不同的处理，有必要获得足够质量和数量的mRNA，以便随后的分析4，5。与DNA相比，RNA对固定更敏感，当目标是研究RNA时，建议使用冷冻组织。由于 mRNA 因无处不在的核糖核酸酶 （RNase） 而迅速降解，因此在试样处理和制备过程中需要严格的无RNase条件，并避免在室温下储存样品。此外，快速技术没有任何长时间的水相步骤是至关重要的，以防止RNA降解6。RNA的产生和完整性也会受到LCM过程和LCM系统使用7，8的影响。目前，有4个不同操作原理的LCM系统可供2。RNA提取方法也很重要，因为不同的RNA分离试剂盒已经过测试，RNA数量和质量有显著差异，7，8。
任何组织制备方法都需要在获得良好的形态对比和保持RNA完整性之间找到平衡，以便进行进一步分析。为了从骨头中制备冷冻部分，开发了一个粘合膜，并持续改进了9。骨部分被切割并直接在粘结膜上染色。这种胶膜适用于多种染色类型，并可用于使用LCM9、10、11、12、13分离感兴趣的细胞和骨低温细胞。 14.所有步骤，包括手术切除，嵌入，冻结，切割和染色可以在不到一小时的时间内完成。重要的是，细胞，如成骨细胞，骨衬里细胞，和成骨细胞可以清楚地识别9，10，11，12，13，14。该方法具有快速简便的优点。生成骨骼冷冻节的另一种方法是使用磁带传输系统15。然而，后一种技术更耗时，需要额外的仪器，因为部分必须通过紫外线（UV）交联将部分从胶带转移到预涂膜幻灯片上。虽然磁带传输系统已成功与 LCM16、17、18、19结合，但需要注意的是，交联涂层可以创建背景模式，可以干扰细胞类型识别20。
通常，只有少量的RNA从微解剖细胞中提取，RNA的质量和数量通常通过微毛细血管电泳21来评估。计算机程序用于为称为RNA完整性数（RIN）的RNA提取物分配质量指数。RIN值1.0表示完全退化的RNA，而值10.0表示RNA完全完好22。通常，超过5的索引被认为足以用于RNA研究。据报道，RIN值为5.0±10.0的样本中的基因表达模式相互关联良好23。虽然这种方法的灵敏度很高，但由于仅能检测到总RNA的50 pg/μL，但如果样品中的RNA浓度非常低，则很难获得质量评估。因此，为了评估RNA的质量，LCM后剩余的组织部分常被用来提取RNA，通过移液缓冲液移至幻灯片24。
虽然LCM已广泛用于不同的冷冻组织，但提取RNA的RIN值很少报告。此外，没有比较研究来阐明研究小鼠骨骼RNA的最适当方法。在本研究中，使用成年小鼠股骨的冷冻部分优化样品制备、LCM协议和RNA提取，以获得高质量的RNA。本协议特别针对使用重力采集样品的LCM系统进行了优化。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA质量和数量在样品制备的所有阶段（如组织操作、LCM 过程和RNA提取）都会受到负面影响。因此，开发了LCM协议，以获得足够数量的高质量RNA，用于后续的基因表达分析。
对于LCM，大多数实验室使用7~8微米厚的2节。较厚的部分将允许收获更多的材料。然而，如果它们太厚，这可能会降低显微分辨率，激光可能无法穿过。最佳组织厚度可能取决于所使用的LCM系统（以?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢乌特·泽茨和尼科尔·金纳的出色技术支持，以及Vetcore和动物护理人员的支持。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
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