En laser Capture Micro Dissection protokol, der giver høj kvalitet RNA fra fersk-frosne mus knogler
Summary
En laser Capture microdissection (LCM) protokol blev udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde af høj kvalitet RNA til genekspression analyse i knogleceller. Den aktuelle undersøgelse fokuserer på musens femur sektioner. Den LCM-protokol, der rapporteres her, kan dog bruges til at studere genekspression i celler i ethvert hårdt væv.
Abstract
RNA-udbytte og-integritet er afgørende for RNA-analyse. Men, det er ofte teknisk udfordrende at opretholde RNA integritet gennem hele laser opsamling microdissection (LCM) procedure. Da LCM-studierne arbejder med lave mængder materiale, er bekymringerne om begrænsede RNA-udbytter også vigtige. Derfor blev en LCM-protokol udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til analyse af genekspression i knogleceller. Virkningen af farvnings protokollen, tykkelsen af kryosektioner, mikrodissekeret vævs mængde, RNA-ekstraktions kit og LCM-system, der anvendes på RNA-udbytte og integritet opnået fra mikrodissekerede knogleceller, blev evalueret. Otte-μm-tykke frosne knogle sektioner blev lavet ved hjælp af en klæbende film og plettet ved hjælp af en hurtig protokol til en kommerciel LCM plet. Prøven blev klemt inde mellem en polyethylenterephthalatmembran (PET) og den selvklæbende folie. Et LCM-system, der bruger tyngdekraften til prøveopsamling og en kolonne baseret RNA-ekstraktionsmetode, blev brugt til at opnå tilstrækkelig udbytte af højkvalitets RNAs. Den aktuelle undersøgelse fokuserer på musens femur sektioner. Den LCM-protokol, der rapporteres her, kan dog bruges til at studere in situ-genekspression i celler i ethvert hårdt væv i både fysiologiske forhold og sygdomsprocesser.
Introduction
Væv består af heterogene og rummæssigt distribuerede celletyper. Forskellige celletyper i et givet væv kan reagere forskelligt på det samme signal. Derfor er det vigtigt at være i stand til at isolere specifikke cellepopulationer til vurdering af rollen af forskellige celletyper i både fysiologiske og patologiske forhold. Laser opsamling microdissection (LCM) tilbyder en relativt hurtig og præcis metode til isolering og fjernelse af specificerede celler fra komplekse væv1. LCM-systemer bruger kraften i en laserstråle til at adskille de celler af interesse fra histologiske vævs sektioner uden behov for enzymatisk behandling eller vækst i kulturen. Det betyder, at cellerne er i deres naturlige vævs habitat, og at vævs arkitekturen, herunder det geografiske forhold mellem forskellige celler, bevares. Morfologi af både de tilfangetagne celler og det resterende væv er velbevaret, og flere vævs komponenter kan udtages sekventielt fra samme slide. Isolerede celler kan derefter anvendes til efterfølgende analyse af deres RNA-, DNA-, protein-eller metabolit-indhold2,3.
For at analysere genekspression i forskellige cellepopulationer, eller efter forskellige behandlinger, er det nødvendigt at få mRNAs af tilstrækkelig kvalitet og mængde til den efterfølgende analyse4,5. I modsætning til DNA er RNAs mere følsomme over for fiksering, og brugen af frosset væv anbefales, når målet er at studere RNA. Da mRNAs hurtigt nedbrydes af allestedsnærværende ribonucleaser (RNase), er der behov for strenge RNase frie forhold under prøvehåndtering og klargøring og undgå opbevaring af prøver ved stuetemperatur. Desuden er hurtige teknikker uden længerevarende vandige fase trin afgørende for at forhindre RNA-nedbrydning6. RNA-udbyttet og-integriteten kan også påvirkes af LCM-processen, og LCM-systemet brugte7,8. I øjeblikket er fire LCM-systemer med forskellige driftsprincipper tilgængelige2. Metoden til RNA-ekstraktion kan også være vigtig, da forskellige RNA-isolations kits er blevet testet med betydelige forskelle i RNA-kvantitet og kvalitet7,8.
Enhver vævs præparationsmetode kræver at finde en balance mellem opnåelse af god morfologisk kontrast og opretholdelse af RNA-integritet til yderligere analyser. Til fremstilling af frosne sektioner fra knogler, en klæbende film blev udviklet og løbende forbedret9. Knogle sektionerne skæres og farves direkte på den selvklæbende film. Denne klæbende film gælder for mange typer af farvning, og kan anvendes til at isolere de celler af interesse fra knogle kryosektioner ved hjælp af LCM9,10,11,12,13, 14. Alle trinene, herunder kirurgisk fjernelse, indlejring, frysning, skæring og farvning kan afsluttes inden for mindre end en time. Det er vigtigt, at celler som osteoblaster, knogle foring celler og osteoklaster tydeligt kan identificeres9,10,11,12,13,14. Denne metode har den fordel at være hurtig og enkel. En alternativ metode til generering af knogle kryosektioner er at bruge tape transfersystemet15. Men sidstnævnte teknik er mere tidskrævende og kræver yderligere instrumentering, da afsnittene skal overføres fra Klæbebåndet til præbelagte membran glider ved ultraviolet (UV) Cross-Linking. Selv om tape transfersystemet er blevet kombineret med LCM16,17,18,19, skal det bemærkes, at den tvær tilknyttede belægning kan skabe et baggrundsmønster, der kan interferere med celle-type identifikation20.
Typisk udvindes kun små mængder af RNA fra mikrodissekerede celler, og RNA-kvalitet og-mængde vurderes ofte ved mikrokapillær elektroforese21. Et edb-program bruges til at tildele et kvalitetsindeks til RNA-ekstrakter kaldet RNA-integritets nummer (RIN). En RIN-værdi på 1,0 indikerer fuldstændig forringet RNA, hvorimod en værdi på 10,0 antyder, at RNA er fuldt intakt22. Normalt, indekser over 5 anses for tilstrækkelige til RNA-undersøgelser. Genekspressions mønstre i prøver med en RIN-værdi på 5,0 − 10,0 er blevet rapporteret til at korrelere godt med hinanden23. Selv om følsomheden af denne metode er høj, da så lidt som 50 PG/μL af total RNA kan påvises, det kan være meget vanskeligt at opnå en kvalitetsvurdering, hvis RNA koncentrationen i prøven er meget lav. For at vurdere RNA-kvaliteten anvendes den vævs sektion, der er tilbage efter LCM’EN, ofte til at udtrække RNA ved pipette Rings buffer på diaset24.
Selvom LCM har været anvendt i udstrakt grad på forskellige frosne væv, er RIN-værdierne af ekstraherede RNAs sjældent indberettet. Desuden er der ingen sammenlignende undersøgelser for at præcisere den mest hensigtsmæssige metode til at studere RNA i mus knogler. I nærværende undersøgelse blev frosne sektioner fra voksne mus skinneben er fuldstændig brugt til at optimere prøveforberedelse, LCM-protokol og RNA-ekstraktion for at opnå højkvalitets RNAs. Denne protokol blev optimeret specielt til LCM-systemet, der bruger tyngdekraften til prøveopsamling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både RNA-kvalitet og-kvantitet kan påvirkes negativt i alle stadier af prøve præparatet, såsom vævs manipulation, LCM-proces og RNA-ekstraktion. Derfor blev en LCM-protokol udviklet for at opnå tilstrækkelig mængde RNA af høj kvalitet til efterfølgende analyse af genekspression.
For LCM bruger de fleste laboratorier sektioner 7 − 8 μm tyk2. Tykkere sektioner ville tillade mere materiale, der skal høstes. Men hvis de er for tykke, kan dette reducere mikroskopisk opløs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Ute Zeitz og Nikole ginner for deres fremragende tekniske hjælp såvel som Vetcore og Animal Care personale for deres støtte.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Referências
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
