एक लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन प्रोटोकॉल जो ताजा-फ्रोज़न माउस हड्डियों से उच्च गुणवत्ता आरएनए पैदाकरता है
Summary
अस्थि कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए एक लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। वर्तमान अध्ययन माउस फीमर वर्गों पर केंद्रित है। हालांकि, LCM प्रोटोकॉल यहाँ की सूचना के लिए किसी भी कठिन ऊतक की कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन किया जा सकता है.
Abstract
आरएनए उपज और अखंडता आरएनए विश्लेषण के लिए निर्णायक हैं. हालांकि, यह अक्सर तकनीकी रूप से पूरे लेजर पर कब्जा microdissection (LCM) प्रक्रिया भर में आरएनए अखंडता बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण है. चूंकि LCM अध्ययन सामग्री की कम मात्रा के साथ काम करते हैं, सीमित आरएनए पैदावार के बारे में चिंता भी महत्वपूर्ण हैं. इसलिए, एक LCM प्रोटोकॉल हड्डी की कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था. दाग प्रोटोकॉल का प्रभाव, cryosections की मोटाई, microdisected ऊतक मात्रा, आरएनए निष्कर्षण किट, और LCM प्रणाली आरएनए उपज और माइक्रोविसेक्टेड हड्डी कोशिकाओं से प्राप्त अखंडता पर इस्तेमाल किया. आठ-m-thick जमे हुए हड्डी वर्गों एक चिपकने वाला फिल्म का उपयोग कर बनाया गया था और एक वाणिज्यिक LCM दाग के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल का उपयोग दाग. नमूना एक पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) झिल्ली और चिपकने वाला फिल्म के बीच sandwiched था. नमूना संग्रह और एक स्तंभ-आधारित आरएनए निष्कर्षण विधि के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करता है एक LCM प्रणाली पर्याप्त उपज के उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया। वर्तमान अध्ययन माउस फीमर वर्गों पर केंद्रित है। हालांकि, LCM प्रोटोकॉल यहाँ की सूचना दोनों शारीरिक स्थितियों और रोग प्रक्रियाओं में किसी भी कठिन ऊतक की कोशिकाओं में situ जीन अभिव्यक्ति में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
ऊतक विषमांगी और स्थानिक रूप से वितरित कोशिका प्रकारों से बने होते हैं। किसी दिए गए ऊतक में विभिन्न सेल प्रकार एक ही संकेत करने के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया कर सकते हैं. इसलिए, यह दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति में विभिन्न सेल प्रकार की भूमिका के आकलन के लिए विशिष्ट सेल आबादी को अलग करने में सक्षम किया जा रहा आवश्यक है. लेजर पर कब्जा microdissection (LCM) जटिल ऊतकों से निर्दिष्ट कोशिकाओं को अलग करने और हटाने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से और सटीक विधि प्रदान करताहै 1. LCM सिस्टम एक लेजर बीम की शक्ति का उपयोग करने के लिए संस्कृति में एंजाइमी प्रसंस्करण या विकास के लिए आवश्यकता के बिना हिस्टोलॉजिकल ऊतक वर्गों से ब्याज की कोशिकाओं को अलग. इसका मतलब यह है कि कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक ऊतक निवास में हैं, और विभिन्न कोशिकाओं के बीच स्थानिक संबंध सहित ऊतक वास्तुकला बनाए रखा है. दोनों पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं और अवशिष्ट ऊतक के Morphology अच्छी तरह से संरक्षित है, और कई ऊतक घटकों एक ही स्लाइड से क्रमिक नमूना किया जा सकता है. इसके बाद अलग-अलग कोशिकाओं का उपयोग उनके आरएनए, डीएनए, प्रोटीन या मेटाबोलाइट सामग्री2,3 के बाद के विश्लेषण के लिए किया जा सकताहै।
विभिन्न कोशिकाओं की जनसंख्या में जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, या विभिन्न उपचारों के बाद, बाद के विश्लेषण4,5के लिए पर्याप्त गुणवत्ता और मात्रा के एम.आर.एन.ए. प्राप्त करना आवश्यक है। डीएनए के विपरीत, आरएनए निर्धारण के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं और जब उद्देश्य आरएनए का अध्ययन करने के लिए है तो जमे हुए ऊतक के उपयोग की सिफारिश की जाती है। चूंकि mRNAs जल्दी सर्वव्यापी ribonucleases (RNase) द्वारा अपमानित कर रहे हैं, नमूना हैंडलिंग और तैयारी और कमरे के तापमान पर नमूनों के भंडारण से बचने के दौरान कड़े RNase मुक्त शर्तों की आवश्यकता है. इसके अतिरिक्त, आरएनए अवक्रमण6को रोकने के लिए लंबे समय तक जलीय चरण के बिना तीव्र तकनीक महत्वपूर्ण है। आरएनए की उपज और सत्यनिष्ठा भी एलसीएम प्रक्रिया से प्रभावित हो सकती है औरएलसीएमप्रणाली का प्रयोग 7,8 किया जा सकताहै. वर्तमान में, विभिन्न ऑपरेटिंग सिद्धांतों के साथ चार LCM सिस्टम उपलब्ध हैं2. आरएनए निष्कर्षण की विधि भी महत्वपूर्ण हो सकती है क्योंकि विभिन्न आरएनए आइसोलेशन किटों का आरएनए मात्रा और गुणवत्ता7,8में महत्वपूर्ण अंतर के साथ परीक्षण किया गया है।
किसी भी ऊतक तैयारी विधि अच्छा आकृतिक विपरीत प्राप्त करने और आगे विश्लेषण के लिए आरएनए अखंडता को बनाए रखने के बीच एक संतुलन खोजने की आवश्यकता है. हड्डी से जमे हुए वर्गों की तैयारी के लिए, एक चिपकने वाला फिल्म विकसित किया गया था और लगातार9में सुधार हुआ. हड्डी वर्गों में कटौती और चिपकने वाला फिल्म पर सीधे दाग रहे हैं. यह चिपकने वाली फिल्म कई प्रकार के दाग लगाने पर लागू होती है, और एलसीएम9, 10 ,11,12,13, का उपयोग करके हड्डियों के क्रायओसेक्शन से ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, 14. शल्य चिकित्सा हटाने, embedding, ठंड, काटने और धुंधला सहित सभी चरणों कम से कम एक घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात यह है कि अस्थिकोरकों , अस्थि अस्तर कोशिकाओं और ऑस्टियोक्लेस्ट जैसी कोशिकाओं की स्पष्ट रूप से पहचान की जा सकती है9,10,11, 12,13,14. इस विधि तेजी से और सरल होने का लाभ है. अस्थि क्रायोसेक्शन उत्पन्न करने का एक वैकल्पिक तरीका टेप स्थानांतरण प्रणाली15का उपयोग करना है . हालांकि, बाद की तकनीक अधिक समय लेने वाली है और अतिरिक्त इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है, क्योंकि वर्गों को पराबैंगनी (यूवी) क्रॉस-लिंकिंग द्वारा पूर्वकोटेड झिल्ली स्लाइड पर चिपकने वाला टेप से स्थानांतरित करना पड़ता है। हालांकि टेप हस्तांतरण प्रणाली सफलतापूर्वक LCM16,17,18,19के साथ युग्मित किया गया है , यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पार से जुड़े कोटिंग एक पृष्ठभूमि पैटर्न बना सकते हैं कि सेल प्रकार पहचान20के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं .
आमतौर पर, आरएनए की केवल छोटी मात्रा में microdisected कोशिकाओं से निकाले जाते हैं, और आरएनए गुणवत्ता और मात्रा अक्सर माइक्रो-केपिला इलेक्ट्रोफोरोसिस21द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं। एक कंप्यूटर प्रोग्राम आरएनए अखंडता संख्या (RIN) कहा जाता है आरएनए अर्क के लिए गुणवत्ता की एक सूचकांक आवंटित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 1ण्0 का RIN मान पूर्ण रूप से निम्नीकृत आरएनए को इंगित करता है, जबकि 10ण्0 का मान यह दर्शाता है कि आरएनए पूरी तरह अक्षुण्ण22है। आमतौर पर, 5 से अधिक अनुक्रमित आरएनए अध्ययन के लिए पर्याप्त माने जाते हैं। 5.0$10.0 के RIN मूल्य वाले नमूनों में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को एक दूसरे के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित करने की सूचना दी गई है23. हालांकि इस विधि की संवेदनशीलता अधिक है, के रूप में छोटे रूप में 50 pg/$L कुल आरएनए का पता लगाया जा सकता है, यह बहुत मुश्किल हो सकता है एक गुणवत्ता मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए यदि नमूने में आरएनए एकाग्रता बहुत कम है. इसलिए, आरएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, एलसीएम के बाद शेष ऊतक अनुभाग अक्सर स्लाइड24पर बफर पाइपिंग द्वारा आरएनए निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है।
हालांकि LCM विभिन्न जमे हुए ऊतकों पर बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, निकाले RNAs के RIN मूल्यों शायद ही कभी सूचित कर रहे हैं. इसके अलावा, माउस हड्डियों में आरएनए का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि को स्पष्ट करने के लिए कोई तुलनात्मक अध्ययन नहीं हैं। वर्तमान अध्ययन में, वयस्क माउस femurs से जमे हुए वर्गों नमूना तैयारी, LCM प्रोटोकॉल और आरएनए निष्कर्षण का अनुकूलन करने के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया. वर्तमान प्रोटोकॉल विशेष रूप से LCM प्रणाली है कि नमूना संग्रह के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करता है के लिए अनुकूलित किया गया था.
Protocol
Representative Results
Discussion
दोनों आरएनए गुणवत्ता और मात्रा इस तरह के ऊतक हेरफेर, LCM प्रक्रिया, और आरएनए निष्कर्षण के रूप में नमूना तैयारी के सभी चरणों में नकारात्मक प्रभावित हो सकता है। इसलिए, एक LCM प्रोटोकॉल बाद जीन अभिव्यक्ति विश?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकअपने उत्कृष्ट तकनीकी मदद के साथ ही उनके समर्थन के लिए Vetcore और पशु देखभाल स्टाफ के लिए Ute zeitz और निकोल Ginner धन्यवाद.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Referências
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