En laser Capture Microdissection protokoll som gir høy kvalitet RNA fra fersk-frosne Mouse Bones
Summary
En LCM-protokoll (laser Capture microdissection) ble utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for analyse av genuttrykk i bein celler. Den nåværende studien fokuserer på musen femur seksjoner. Imidlertid kan LCM protokollen som rapporteres her brukes til å studere genuttrykk i celler av noe hardt vev.
Abstract
RNA-utbytte og-integritet er avgjørende for RNA-analyse. Det er imidlertid ofte teknisk utfordrende å opprettholde RNA-integritet gjennom hele laser opptaks microdissection (LCM). Siden LCM-studier arbeider med lave mengder materiale, er det også viktig å ta hensyn til begrensede RNA-avlinger. Derfor ble en LCM-protokoll utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for analyse av genuttrykk i bein celler. Effekten av fargeprotokoll, tykkelse av cryosections, microdissected vevs mengde, RNA utvinnings sett og LCM-system som ble brukt på RNA-utbytte og integritet innhentet fra microdissected bein celler ble evaluert. Åtte μm-tykke frosne bein seksjoner ble gjort ved hjelp av en selvklebende film og beiset bruke en rask protokoll for en kommersiell LCM beis. Prøven var klemt mellom en polyetylen polyetylentereftalat (PET) membran og limet film. Et LCM-system som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling og en kolonne-basert RNA utvinning metoden ble brukt for å oppnå høy kvalitet RNAs av tilstrekkelig yield. Den nåværende studien fokuserer på musen femur seksjoner. Imidlertid kan LCM protokollen som rapporteres her brukes til å studere in situ genuttrykk i celler av noe hardt vev i både fysiologiske forhold og sykdoms prosesser.
Introduction
Vev består av heterogene og romlig distribuerte celletyper. Forskjellige celletyper i et gitt vev kan reagere forskjellig på det samme signalet. Derfor er det viktig å kunne isolere bestemte celle populasjoner for vurdering av rollen til ulike celletyper i både fysiologiske og patologiske tilstander. Laser fangst microdissection (LCM) tilbyr en relativt rask og presis metode for å isolere og fjerne spesifiserte celler fra komplekse vev1. LCM systemer bruke kraften i en laserstråle for å skille celler av interesse fra histologiske vev seksjoner uten behov for enzymatisk behandling eller vekst i kultur. Dette betyr at cellene er i deres naturlige vev habitat, og at vev arkitektur inkludert romlige forholdet mellom ulike celler beholdes. Morfologi av både fanget celler og det resterende vevet er godt bevart, og flere vevs komponenter kan samples sekvensielt fra samme lysbilde. Isolerte celler kan deretter brukes til senere analyse av RNA, DNA, protein eller metabolitten innhold2,3.
For å analysere genuttrykk i forskjellige celle populasjoner, eller etter ulike behandlinger, er det nødvendig å oppnå mRNAs av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for den påfølgende analysen4,5. I motsetning til DNA, RNAs er mer følsomme for fiksering og bruk av frossen vev anbefales når målet er å studere RNA. Siden mRNAs raskt forringes av allestedsnærværende ribonucleases (RNase), er strenge RNase-frie forhold under prøvehåndtering og-tilberedning og å unngå lagring av prøver ved romtemperatur nødvendig. I tillegg er raske teknikker uten langvarige vandige fase trinn avgjørende for å hindre RNA-forringelse6. Den RNA yield og integritet kan også påvirkes av LCM prosessen og LCM systemet brukes7,8. Foreløpig er fire LCM systemer med ulike driftsprinsipper tilgjengelig2. Metoden for RNA-ekstraksjon kan også være viktig, siden ulike RNA isolasjons sett har blitt testet med betydelige forskjeller i RNA-kvantitet og kvalitet på7,8.
Enhver vevs Forberedelses metode krever å finne en balanse mellom å oppnå god morfologiske kontrast og opprettholde RNA integritet for videre analyser. For å forberede frosne seksjoner fra bein, ble en selvklebende film utviklet og kontinuerlig forbedret9. Benet seksjoner er kuttet og beiset direkte på limet filmen. Denne selvklebende filmen gjelder for mange typer farging, og kan brukes til å isolere cellene av interesse fra bein cryosections bruker LCM9,10,11,12,13, 14i det. Alle trinnene inkludert kirurgisk fjerning, innebygging, frysing, skjæring og farging kan gjennomføres innen mindre enn en time. Viktigere, celler som osteoblaster, bein fôr celler, og osteoklaster kan tydelig identifiseres9,10,11,12,13,14. Denne metoden har fordelen av å være rask og enkel. En alternativ metode for generering av bein cryosections er å bruke bånd overføringssystemet15. Men den sistnevnte teknikken er mer tidkrevende og krever ekstra instrumentering, siden seksjonene må overføres fra selvklebende tape på precoated membran lysbilder av ultrafiolett (UV) kryss-linking. Selv om tape Transfer systemet har blitt koblet sammen med LCM16,17,18,19, bør det bemerkes at tverrbundet belegg kan skape et bakgrunnsmønster som kan forstyrre celle type identifikasjon20.
Vanligvis trekkes bare små mengder RNA ut fra microdissected celler, og RNA-kvalitet og kvantitet vurderes ofte av mikro-kapillær elektroforese21. Et dataprogram brukes til å tilordne en indeks av kvalitet til RNA-ekstrakter som kalles RNA-nummer ((RIN)). En RIN-verdi på 1,0 indikerer fullstendig degradert RNA, mens en verdi på 10,0 antyder at RNA-en er helt intakt22. Vanligvis anses indekser over 5 som tilstrekkelige for RNA-studier. Gen uttrykks mønstre i prøver med en RIN-verdi på 5,0 − 10.0 har blitt rapportert å koordinere godt med hverandre23. Selv om følsomheten til denne metoden er høy, siden så lite som 50 PG/μL av total RNA kan oppdages, kan det være svært vanskelig å få en kvalitetsvurdering hvis RNA-konsentrasjonen i prøven er svært lav. Derfor, for å vurdere RNA kvalitet, er vevs delen som gjenstår etter LCM ofte brukt til å trekke ut RNA, ved pipettering buffer på Slide24.
Selv om LCM har blitt brukt mye på forskjellige frosne vev, RIN verdier av utpakkede RNAs er sjelden rapportert. Videre er det ingen sammenlignende studier for å avklare den mest hensiktsmessige metoden for å studere RNA i mus bein. I denne studien, frosne seksjoner fra voksen mus femurs ble brukt til å optimalisere prøve forberedelser, LCM protokoll og RNA utvinning for å oppnå høy kvalitet RNAs. Den nåværende protokollen ble optimalisert spesielt for LCM-systemet som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både RNA-kvalitet og-mengde kan påvirkes negativt på alle stadier i prøve forberedelsen, for eksempel vevs manipulasjon, LCM-prosessen og RNA-ekstraksjon. Derfor ble en LCM-protokoll utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for påfølgende analyse av genuttrykk.
For LCM bruker de fleste laboratorier seksjoner 7 − 8 μm tykke2. Tykkere seksjoner ville tillate mer materiale som skal høstes. Men hvis de er for tykke, kan dette redusere mikroskopisk oppl?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker ute Zeitz og Nikole Ginner for deres utmerkede teknisk hjelp samt Vetcore og dyr omsorg ansatte for deres støtte.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Referências
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
