Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados
Summary
Se desarrolló un protocolo de microdisección de captura láser (LCM) para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica en células de cualquier tejido duro.
Abstract
El rendimiento y la integridad del ARN son decisivos para el análisis del ARN. Sin embargo, a menudo es técnicamente difícil mantener la integridad del ARN a lo largo de todo el procedimiento de microdisección de captura láser (LCM). Dado que los estudios de LCM funcionan con cantidades bajas de material, también son importantes las preocupaciones sobre los rendimientos limitados del ARN. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. Se evaluó el efecto del protocolo de tinción, el grosor de las criosecciones, la cantidad de tejido microdiseccionado, el kit de extracción de ARN y el sistema LCM utilizado en el rendimiento del ARN y la integridad obtenida de las células óseas microdiseccionadas. Las secciones óseas congeladas de ocho m de espesor se hicieron con una película adhesiva y se teñiron utilizando un protocolo rápido para una mancha comercial de LCM. La muestra se emparedó entre una membrana de tereftalato de polietileno (PET) y la película adhesiva. Un sistema LCM que utiliza la gravedad para la recolección de muestras y un método de extracción de ARN basado en columnas se utilizaron para obtener ARN de alta calidad de rendimiento suficiente. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica in situ en células de cualquier tejido duro tanto en condiciones fisiológicas como en procesos de la enfermedad.
Introduction
Los tejidos se componen de tipos de células heterogéneas y distribuidas espacialmente. Diferentes tipos de células en un tejido dado pueden responder de manera diferente a la misma señal. Por lo tanto, es esencial poder aislar poblaciones celulares específicas para la evaluación del papel de los diferentes tipos de células tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. La microdisección de captura láser (LCM) ofrece un método relativamente rápido y preciso para aislar y extraer células especificadas de tejidos complejos1. Los sistemas LCM utilizan el poder de un rayo láser para separar las células de interés de las secciones del tejido histológico sin necesidad de procesamiento enzimático o crecimiento en cultivo. Esto significa que las células están en su hábitat de tejido natural, y que la arquitectura del tejido incluyendo la relación espacial entre las diferentes células se mantiene. La morfología de las células capturadas y del tejido residual está bien conservada, y varios componentes de tejido se pueden muestrear secuencialmente desde la misma diapositiva. Las células aisladas se pueden utilizar para el análisis posterior de su ARN, ADN, proteína o contenido demetabolito2,3.
Para analizar la expresión génica en diferentes poblaciones celulares, o después de diferentes tratamientos, es necesario obtener ARNm de calidad y cantidad suficientes para el análisis posterior4,5. A diferencia del ADN, los ARN son más sensibles a la fijación y se recomienda el uso de tejido congelado cuando el objetivo es estudiar el ARN. Dado que los ARNm se degradan rápidamente por ribonucleasas ubicuas (RNase), se requieren condiciones estrictas libres de RNase durante la manipulación y preparación de muestras y evitar el almacenamiento de muestras a temperatura ambiente. Además, las técnicas rápidas sin pasos prolongados de fase acuosa son cruciales para prevenir la degradación del ARN6. El rendimiento y la integridad del ARN también pueden verse afectados por el proceso LCM y el sistema LCM utilizado7,8. Actualmente, hay disponibles cuatro sistemas LCM con diferentes principios de funcionamiento2. El método de extracción de ARN también puede ser importante, ya que se han probado diferentes kits de aislamiento de ARN con diferencias significativas en la cantidad de ARN y la calidad7,8.
Cualquier método de preparación de tejidos requiere encontrar un equilibrio entre obtener un buen contraste morfológico y mantener la integridad del ARN para análisis posteriores. Para la preparación de secciones congeladas a partir de hueso, se desarrolló una película adhesiva y se mejoró continuamente9. Las secciones óseas se cortan y se tiñen directamente sobre la película adhesiva. Esta película adhesiva es aplicable a muchos tipos de tinción, y se puede emplear para aislar las células de interés de las criosecciones óseas utilizando LCM9,10,11,12,13, 14. Todos los pasos, incluyendo la extracción quirúrgica, incrustación, congelación, corte y tinción se pueden completar en menos de una hora. Es importante destacar que las células como osteoblastos, células del revestimiento óseo y osteoclastos se pueden identificar claramente9,10,11,12,13,14. Este método tiene la ventaja de ser rápido y simple. Un método alternativo para generar criosecciones óseas es utilizar el sistema de transferencia de cinta15. Sin embargo, esta última técnica consume más tiempo y requiere instrumentación adicional, ya que las secciones tienen que ser transferidas desde la cinta adhesiva a diapositivas de membrana preenreadas por la reticulación ultravioleta (UV). Aunque el sistema de transferencia de cinta se ha acoplado con éxito con LCM16,17,18,19, debe tenerse en cuenta que el recubrimiento reticulado puede crear un patrón de fondo que puede interferir con la identificación de tipo de celda20.
Típicamente, sólo pequeñas cantidades de ARN se extraen de células microdisectadas, y la calidad y cantidad del ARN a menudo se evalúan por electroforesis microcapilar21. Un programa informático se utiliza para asignar un índice de calidad a extractos de ARN llamados número de integridad de ARN (RIN). Un valor RIN de 1,0 indica ARN completamente degradado, mientras que un valor de 10,0 sugiere que el ARN está totalmente intacto22. Por lo general, los índices de más de 5 se consideran suficientes para los estudios de ARN. Se han notificado patrones de expresión génica en muestras con un valor De RIN de 5,0 a 10,0 que se correlacionan bien entresí 23. Aunque la sensibilidad de este método es alta, ya que se puede detectar tan solo 50 pg/L de ARN total, puede ser muy difícil obtener una evaluación de calidad si la concentración de ARN en la muestra es muy baja. Por lo tanto, con el fin de evaluar la calidad del ARN, la sección de tejido restante después del LCM se utiliza a menudo para extraer el ARN, mediante el tampón de pipeteo en la diapositiva24.
Aunque LCM se ha utilizado ampliamente en diferentes tejidos congelados, los valores DeR de ARN extraídos rara vez se notifican. Además, no existen estudios comparativos para aclarar el método más adecuado para estudiar el ARN en los huesos del ratón. En el presente estudio, se utilizaron secciones congeladas de fémures ratón adultos para optimizar la preparación de la muestra, el protocolo LCM y la extracción de ARN con el fin de obtener ARN de alta calidad. El protocolo actual fue optimizado particularmente para el sistema LCM que utiliza la gravedad para la recolección de muestras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanto la calidad como la cantidad de ARN pueden verse afectadas negativamente en todas las etapas de la preparación de la muestra, como la manipulación de tejidos, el proceso de LCM y la extracción de ARN. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el posterior análisis de la expresión génica.
Para LCM, la mayoría de los laboratorios utilizan secciones de 7 a 8 m de espesor2. Las secciones más gruesas permit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Ute Zeitz y Nikole Ginner por su excelente ayuda técnica, así como al personal de Vetcore y de cuidado de animales por su apoyo.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Referências
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