En laser Capture Microdissection protokoll som ger hög kvalitet RNA från färsk frysta mus ben
Summary
Ett protokoll för Lasers avskiljning av mikrodissektion (LCM) utvecklades för att erhålla tillräcklig mängd högkvalitativt RNA för gen uttrycks analys i benceller. Den aktuella studien fokuserar på mus lårbenet sektioner. Emellertid, den LCM protokoll som rapporteras här kan användas för att studera genuttryck i celler av någon hård vävnad.
Abstract
RNA-avkastning och integritet är avgörande för RNA-analys. Emellertid, det är ofta tekniskt utmanande att upprätthålla RNA integritet genom hela laser Capture microdissection (LCM) förfarande. Eftersom LCM-studierna fungerar med små mängder material är oron för begränsade RNA-avkastningar också viktig. Därför utvecklades ett LCM-protokoll för att erhålla tillräcklig mängd högkvalitativt RNA för gen uttrycks analys i benceller. Effekten av färgning protokoll, tjocklek kryosektioner, microdissekerade vävnad kvantitet, RNA extraktion kit, och LCM system som används på RNA avkastning och integritet som erhållits från microdissekerade benceller utvärderades. Åtta μm tjocka frysta ben sektioner gjordes med hjälp av en självhäftande film och färgas med hjälp av en snabb protokoll för en kommersiell LCM fläck. Provet var inklämt mellan ett polyetylentereftalat (PET) membran och självhäftande film. Ett LCM-system som använder gravitationen för provinsamling och en kolumnbaserad RNA-extraktionsmetod användes för att få en högkvalitativ RNAs med tillräcklig avkastning. Den aktuella studien fokuserar på mus lårbenet sektioner. Emellertid, det LCM-protokoll som rapporteras här kan användas för att studera in situ genuttryck i celler av någon hård vävnad i både fysiologiska förhållanden och sjukdomsprocesser.
Introduction
Vävnader består av heterogena och rumsligt distribuerade celltyper. Olika celltyper i en given vävnad kan reagera olika på samma signal. Därför är det viktigt att kunna isolera specifika cellpopulationer för att bedöma vilken roll olika celltyper har i både fysiologiska och patologiska förhållanden. Laser Capture microdissection (LCM) erbjuder en relativt snabb och exakt metod för att isolera och ta bort specificerade celler från komplexa vävnader1. LCM system använder kraften i en laserstråle för att separera cellerna av intresse från histologiska vävnad sektioner utan behov av enzymatisk bearbetning eller tillväxt i kulturen. Detta innebär att cellerna är i deras naturliga vävnad livsmiljö, och att vävnads arkitektur inklusive det rumsliga förhållandet mellan olika celler bevaras. Morfologin av både de fångade cellerna och den kvarvarande vävnaden är väl bevarad, och flera vävnads komponenter kan samplas sekventiellt från samma bild. Isolerade celler kan sedan användas för efterföljande analys av deras RNA, DNA, protein eller metabolit innehåll2,3.
För att kunna analysera genuttryck i olika cellpopulationer, eller efter olika behandlingar, är det nödvändigt att få mRNA av tillräcklig kvalitet och kvantitet för den efterföljande analysen4,5. I motsats till DNA är RNAs känsligare för fixering och användning av fryst vävnad rekommenderas när målet är att studera RNA. Eftersom mrnas snabbt bryts ned av allestädes närvarande ribonucleases (RNase), krävs stränga RNase-fria förhållanden under preparat hantering och beredning och att man undviker lagring av prover vid rumstemperatur. Dessutom är snabba tekniker utan några förlängda vattenfas steg avgörande för att förhindra RNA-nedbrytning6. RNA-avkastningen och integriteten kan också påverkas av LCM-processen och LCM-systemet används7,8. För närvarande finns fyra LCM-system med olika driftsprinciper tillgängliga2. Metoden för RNA-extraktion kan också vara viktig, eftersom olika RNA-isolerings satser har testats med signifikanta skillnader i RNA-mängd och kvalitet7,8.
Varje vävnads beredningsmetod kräver att man hittar en balans mellan att erhålla god morfologisk kontrast och bibehålla RNA-integriteten för ytterligare analyser. För beredning av frysta sektioner från ben, utvecklades en självhäftande film och förbättrades kontinuerligt9. Ben sektionerna skärs och färgas direkt på den självhäftande filmen. Denna självhäftande film är tillämplig på många typer av färgning, och kan användas för att isolera cellerna av intresse från benkryosektioner med hjälp av LCM9,10,11,12,13, 14. Alla steg inklusive kirurgiskt avlägsnande, inbäddning, frysning, skärning och färgning kan slutföras inom mindre än en timme. Viktigt är att celler som osteoblaster, ben foder celler och osteoklaster tydligt kan identifieras9,10,11,12,13,14. Denna metod har fördelen av att vara snabb och enkel. En alternativ metod för att skapa benkryosektioner är att använda band överföringssystemet15. Men den senare tekniken är mer tidskrävande och kräver ytterligare instrumentering, eftersom avsnitten måste överföras från den självhäftande tejpen på förbelagts membran diabilder med ultraviolett (UV) cross-linking. Även om bandet överföringssystemet har framgångsrikt i kombination med LCM16,17,18,19, bör det noteras att tvärbunden beläggning kan skapa ett bakgrundsmönster som kan störa cell typs identifieringen20.
Typiskt, endast små mängder av RNA utvinns ur microdissekerade celler, och RNA kvalitet och kvantitet bedöms ofta av mikro-kapillär elektrofores21. Ett datorprogram används för att tilldela ett index av kvalitet till RNA-extrakt som kallas RNA Integrity Number (RIN). Ett RIN-värde på 1,0 indikerar helt försämrad RNA, medan värdet 10,0 antyder att RNA är helt intakt22. Vanligtvis, index över 5 anses tillräckliga för RNA-studier. Gen uttrycksmönster i prover med ett RIN-värde på 5,0 − 10,0 har rapporterats korrelera väl med varandra23. Även om känsligheten hos denna metod är hög, eftersom så lite som 50 PG/μL av totalt RNA kan upptäckas, kan det vara mycket svårt att få en kvalitetsbedömning om RNA-koncentrationen i provet är mycket låg. Därför, för att bedöma RNA-kvalitet, vävnads sektionen kvar efter LCM används ofta för att extrahera RNA, genom pipettering buffert på bild24.
Även om LCM har använts i stor utsträckning på olika frysta vävnader, är RIN värden av extraherade RNAs sällan rapporteras. Vidare finns det inga jämförande studier för att klargöra den lämpligaste metoden för att studera RNA i mus benen. I den föreliggande studien användes frysta sektioner från femurer för vuxna möss för att optimera provpreparering, LCM-protokoll och RNA-extraktion för att få högkvalitativa RNAs. Det nuvarande protokollet har optimerats särskilt för LCM-systemet som använder gravitationen för provinsamling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både RNA-kvalitet och-mängd kan påverkas negativt i alla stadier av prov preparationen, såsom vävnads manipulation, LCM-process och RNA-extraktion. Därför utvecklades ett LCM-protokoll för att erhålla tillräckligt mycket högkvalitativt RNA för efterföljande gen uttrycks analys.
För LCM använder de flesta laboratorier avsnitt 7 − 8 μm tjock2. Tjockare sektioner skulle göra det möjligt att skörda mer material. Men om de är för tjocka, kan detta minska mikroskopi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar ute Zeitz och Nikole Ginner för deras utmärkta tekniska hjälp samt Vetcore och djuromsorg personal för deras stöd.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Referências
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
