Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü
Summary
Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.
Abstract
RNA verimi ve bütünlüğü RNA analizi için belirleyicidir. Ancak, tüm lazer yakalama mikrodisesi (LCM) prosedürü boyunca RNA bütünlüğünü korumak genellikle teknik olarak zordur. LCM çalışmaları düşük miktarda malzeme ile çalıştığı için, sınırlı RNA verimleri ile ilgili endişeler de önemlidir. Bu nedenle kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir. Boyama protokolünün etkisi, kriyokesit kalınlığı, mikrodiskoplu doku miktarı, RNA ekstraksiyon kiti ve Mikrodissected kemik hücrelerinden elde edilen RNA verimi ve bütünlüğü üzerine kullanılan LCM sistemi değerlendirildi. Sekiz μm kalınlığında dondurulmuş kemik bölümleri yapışkan film kullanılarak yapılmış ve ticari bir LCM lekesi için hızlı bir protokol kullanılarak boyanmış. Örnek polietilen tereftalat (PET) membran ve yapışkan film arasında sıkışmış oldu. Yeterli verimde yüksek kaliteli RNA’lar elde etmek için numune toplama için yerçekimi ni kullanan bir LCM sistemi ve kolon tabanlı RNA çıkarma yöntemi kullanılmıştır. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü hem fizyolojik koşullarda hem de hastalık süreçlerinde herhangi bir sert doku hücrelerinde yerinde gen ekspresyonunda çalışmak için kullanılabilir.
Introduction
Dokular heterojen ve uzamsal olarak dağılmış hücre tiplerinden oluşur. Belirli bir dokudaki farklı hücre tipleri aynı sinyale farklı yanıt verebilir. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullarda farklı hücre tiplerinin rolünün değerlendirilmesi için belirli hücre popülasyonlarını izole edebilmek esastır. Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) karmaşık dokulardan belirtilen hücreleri izole etmek ve kaldırmak için nispeten hızlı ve hassas bir yöntem sunar1. LCM sistemleri, enzimatik işleme veya kültür de büyüme gerek kalmadan histolojik doku bölümlerinden ilgi hücreleri ayırmak için bir lazer ışını nın gücünü kullanın. Bu, hücrelerin doğal doku habitatlarında olduğu ve farklı hücreler arasındaki mekansal ilişkiyi de içeren doku mimarisinin korundiğı anlamına gelir. Hem yakalanan hücrelerin hem de artık dokunun morfolojisi iyi korunmuştur ve aynı slayttan birkaç doku bileşeni sırayla örneklenebilir. İzole hücreler daha sonra RNA, DNA, protein veya metabolit içeriği nin sonraki analizi için kullanılabilir2,3.
Farklı hücre popülasyonlarında veya farklı tedavilerden sonra gen ekspresyonunu analiz etmek için, sonraki analiz için yeterli kalite ve nicelikte mRNA’lar elde etmek gerekir4,5. DNA’nın aksine, RNA’lar fiksasyona karşı daha duyarlıdır ve amaç RNA’yı incelemek olduğunda dondurulmuş doku kullanımı önerilir. MRNA’lar her yerde bulunan ribonükleazlar (RNase) tarafından hızla bozulduğu için, numune işleme ve hazırlama sırasında sıkı RNase içermeyen koşullar ve numunelerin oda sıcaklığında depolanmasından kaçınmak gereklidir. Buna ek olarak, herhangi bir uzun sulu faz adımları olmadan hızlı teknikler RNA bozulmasını önlemek için çok önemlidir6. RNA verimi ve bütünlüğü de LCM işlemi ve Kullanılan LCM sistemi etkilenebilir7,8. Şu anda, farklı çalışma prensipleri ile dört LCM sistemleri mevcuttur2. Farklı RNA izolasyon kitleri RNA miktarı ve kalite7,8önemli farklılıklar ile test edilmiştir beri RNA ekstraksiyon yöntemi de önemli olabilir.
Herhangi bir doku hazırlama yöntemi iyi morfolojik kontrast elde etmek ve daha fazla analiz için RNA bütünlüğünü korumak arasında bir denge bulma gerektirir. Kemikten dondurulmuş kesitler hazırlamak için, bir yapıştırıcı film geliştirilmiş ve sürekligeliştirilmiş 9. Kemik bölümleri kesilir ve doğrudan yapışkan film üzerine boyanmaktadır. Bu yapışkan film boyama birçok türleri için geçerlidir, ve LCMkullanarakkemik kriyokesitlerden ilgi hücreleri izole etmek için istihdam edilebilir 9,10,11,12,13, 14. Cerrahi çıkarma, gömme, dondurma, kesme ve boyama dahil tüm adımlar bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Daha da önemlisi, osteoblastlar, kemik astar hücreleri ve osteoklastlar gibi hücreler açıkça9,10,11,12,13,14olarak tanımlanabilir. Bu yöntem hızlı ve basit olma avantajına sahiptir. Kemik kriyokesitleri oluşturmak için alternatif bir yöntem bant transfer sistemi15kullanmaktır. Ancak, ikinci teknik daha zaman alıcıdır ve ek enstrümantasyon gerektirir, çünkü bölümler yapışkan banttan ultraviyole (UV) çapraz bağlama ile önceden kaplanmış membran slaytlara aktarılması gerekir. Bant aktarım sistemi başarıyla LCM16,17,18,19ile birleştiğinde olmasına rağmen, çapraz bağlı kaplama bir arka plan deseni oluşturabilirsiniz unutulmamalıdır hücre tipi tanımlama20ile müdahale edebilir.
Tipik olarak, mikrodiskoplu hücrelerden sadece küçük miktarda RNA çıkarılır ve RNA kalitesi ve miktarı genellikle mikro-kılcal elektroforez21ile değerlendirilir. Bir bilgisayar programı RNA bütünlük numarası (RIN) olarak adlandırılan RNA özleri kalite dizini atamak için kullanılır. 1.0’lık RIN değeri tamamen bozulmuş RNA’yı gösterirken, 10,0 değeri RNA’nın tamamen sağlam olduğunu gösterir22. Genellikle, 5 üzerinde indeksler RNA çalışmaları için yeterli olarak kabul edilir. RIN değeri 5.0−10.0 olan örneklerdeki gen ekspresyonu desenlerinin birbiriyle iyi ilişkili olduğubildirilmiştir 23. Bu yöntemin duyarlılığı yüksek olmasına rağmen, toplam RNA’nın 50 pg/μL’si kadar az tespit edilebildiği için, numunedeki RNA konsantrasyonu çok düşükse kalite değerlendirmesi elde etmek çok zor olabilir. Bu nedenle, RNA kalitesini değerlendirmek için, LCM’den sonra kalan doku bölümü genellikle24numaralı slayta tampon ıslatarak RNA’yı ayıklamak için kullanılır.
LCM farklı dondurulmuş dokularda yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, çıkarılan RNA’ların RIN değerleri nadiren rapor edilir. Ayrıca, fare kemiklerinde RNA’yı incelemek için en uygun yöntemi açıklığa kavuşturmak için karşılaştırmalı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, yüksek kaliteli RNA elde etmek için numune hazırlama, LCM protokolü ve RNA ekstraksiyonu optimize etmek için yetişkin fare uyluk kemiğinden dondurulmuş kesitler kullanılmıştır. Bu protokol özellikle numune toplama için yerçekimi kullanan LCM sistemi için optimize edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hem RNA kalitesi hem de miktarı doku manipülasyonu, LCM prosesi ve RNA ekstraksiyonu gibi numune hazırlamanın tüm aşamalarında olumsuz etkilenebilir. Bu nedenle, sonraki gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir.
LCM için çoğu laboratuvar 7−8 μm kalınlığında2. Kalın kesitler daha fazla malzemenin hasat edilmesine olanak sağlayacaktır. Ancak, çok kalın ise, bu mikroskobik çözünü…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ute Zeitz ve Nikole Ginner onların mükemmel teknik yardım yanı sıra destek için Vetcore ve hayvan bakım personeli için teşekkür ederiz.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Referências
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
