Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten
Summary
Een laser Capture microdissection (LCM)-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Het hier gerapporteerde LCM-protocol kan echter worden gebruikt om genexpressie in cellen van een hard weefsel te bestuderen.
Abstract
RNA-opbrengst en-integriteit zijn bepalend voor RNA-analyse. Echter, het is vaak technisch uitdagend om te handhaven RNA-integriteit gedurende de gehele Laser Capture microdissection (LCM) procedure. Aangezien LCM-studies werken met lage hoeveelheden materiaal, zijn bezorgdheid over beperkte RNA-opbrengsten ook belangrijk. Daarom werd een LCM-protocol ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. Het effect van kleurings protocol, dikte van cryosecties, microdissected weefsel hoeveelheid, RNA-extractie Kit en LCM-systeem dat wordt gebruikt op RNA-opbrengst en integriteit verkregen uit microdissected-botcellen werd geëvalueerd. De diepgevroren botgedeelten van acht μm werden gemaakt met behulp van een zelfklevende folie en bevlekt met een snel protocol voor een commerciële LCM vlek. Het monster werd ingeklemd tussen een polyethyleentereftalaat (PET) membraan en de zelfklevende folie. Een LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterafname en een op kolom gebaseerde RNA-extractiemethode werden gebruikt om hoge kwaliteit Rna’s van voldoende opbrengst te verkrijgen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Echter, de hier gerapporteerde LCM protocol kan worden gebruikt om te studeren in situ genexpressie in cellen van een hard weefsel in zowel fysiologische omstandigheden en ziekteprocessen.
Introduction
Weefsels bestaan uit heterogene en ruimtelijk gedistribueerde celtypen. Verschillende celtypen in een bepaald weefsel kunnen verschillend reageren op hetzelfde signaal. Daarom is het essentieel om specifieke celpopulaties te isoleren voor de beoordeling van de rol van verschillende celtypen in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Laser Capture microdissection (LCM) biedt een relatief snelle en precieze methode voor het isoleren en verwijderen van gespecificeerde cellen uit complexe weefsels1. LCM-systemen gebruiken de kracht van een laserstraal om de cellen van belang van histologische weefsel secties te scheiden zonder de noodzaak voor enzymatische verwerking of groei in cultuur. Dit betekent dat de cellen in hun natuurlijke weefsel habitat, en dat weefsel architectuur met inbegrip van de ruimtelijke relatie tussen de verschillende cellen behouden blijft. Morfologie van zowel de gevangen cellen als het rest weefsel is goed bewaard gebleven, en verschillende weefsel componenten kunnen opeenvolgend uit dezelfde dia worden bemonsterd. Geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de daaropvolgende analyse van hun RNA-, DNA-, eiwit-of metaboliet gehalte2,3.
Om genexpressie in verschillende celpopulaties of na verschillende behandelingen te analyseren, is het noodzakelijk om mrna’s van voldoende kwaliteit en kwantiteit te verkrijgen voor de daaropvolgende analyse4,5. In tegenstelling tot DNA zijn Rna’s gevoeliger voor fixatie en wordt het gebruik van bevroren weefsel aanbevolen wanneer het doel is om RNA te bestuderen. Aangezien Mrna’s snel worden afgebroken door alomtegenwoordige ribonucleases (RNase), zijn strenge RNase-vrije condities tijdens het hanteren en voorbereiden van het preparaat en het vermijden van opslag van monsters bij kamertemperatuur vereist. Bovendien zijn snelle technieken zonder verlengde waterige fase stappen cruciaal om RNA afbraak6te voorkomen. Het RNA-rendement en de integriteit kunnen ook worden beïnvloed door het LCM-proces en het LCM-systeem dat7,8wordt gebruikt. Momenteel zijn er vier LCM-systemen met verschillende werkingsprincipes beschikbaar2. De methode van RNA-extractie kan ook belangrijk zijn, omdat verschillende RNA-isolatiekits zijn getest met aanzienlijke verschillen in RNA-hoeveelheid en kwaliteit7,8.
Elke weefsel bereidingsmethode vereist het vinden van een evenwicht tussen het verkrijgen van een goed morfologisch contrast en het behoud van RNA-integriteit voor verdere analyses. Voor het klaarmaken van bevroren delen van bot, werd een zelfklevende film ontwikkeld en continu verbeterd9. De botten secties worden gesneden en direct op de zelfklevende folie gekleurd. Deze zelfklevende folie is toepasbaar op vele soorten vlekken, en kan worden gebruikt om de cellen van belang te isoleren van botcryosecties met behulp van LCM9,10,11,12,13, 14. Alle stappen, waaronder de chirurgische verwijdering, inbedding, invriezen, snijden en vlekken, kunnen binnen minder dan een uur worden voltooid. Belangrijk is dat cellen zoals osteoblasten, botvoercellen en osteoclasten duidelijk kunnen worden geïdentificeerd9,10,11,12,13,14. Deze methode heeft het voordeel dat het snel en eenvoudig is. Een alternatieve methode voor het genereren van botcryosecties is het gebruik van het tape transfersysteem15. De laatste techniek is echter meer tijdrovend en vereist extra instrumentatie, omdat de secties van de plakband moeten worden overgebracht naar voorgecoate membraan glaasjes door ultraviolette (UV) Cross-linking. Hoewel het tape transfersysteem met succes is gekoppeld aan LCM16,17,18,19, moet worden opgemerkt dat de kruislings gekoppelde coating een achtergrond patroon kan creëren dat kan interfereren met cel-type identificatie20.
Typisch, slechts kleine hoeveelheden van RNA worden geëxtraheerd uit micro-ontleed cellen, en RNA kwaliteit en kwantiteit worden vaak beoordeeld door micro-capillaire elektroforese21. Een computerprogramma wordt gebruikt om een index van kwaliteit toe te wijzen aan RNA-extracten die RNA-integriteits nummer (RIN) worden genoemd. Een RIN-waarde van 1,0 duidt volledig gedegradeerd RNA aan, terwijl een waarde van 10,0 suggereert dat het RNA volledig intact is22. Meestal worden indexen van meer dan 5 voldoende geacht voor RNA-studies. Genexpressie patronen in monsters met een RIN-waarde van 5,0 − 10,0 zijn gemeld om goed te correleren met elkaar23. Hoewel de gevoeligheid van deze methode hoog is, omdat er zo weinig als 50 pg/μL van totaal RNA kan worden gedetecteerd, kan het zeer moeilijk zijn om een kwaliteitsbeoordeling te verkrijgen als de RNA-concentratie in het monster zeer laag is. Daarom, om de kwaliteit van RNA te beoordelen, wordt de weefsel sectie die overblijft na de LCM vaak gebruikt om RNA te extraheren, door Pipetteer buffer op de dia24.
Hoewel LCM op grote schaal is gebruikt op verschillende bevroren weefsels, worden de RIN-waarden van geëxtraheerde Rna’s zelden gerapporteerd. Bovendien zijn er geen vergelijkende studies om de meest geschikte methode voor het bestuderen van RNA in muis botten te verduidelijken. In de huidige studie werden bevroren delen van volwassen muis dijbeen gebruikt om de monstervoorbereiding, het LCM-protocol en de RNA-extractie te optimaliseren om hoge kwaliteit rna’s te verkrijgen. Het huidige protocol is speciaal geoptimaliseerd voor het LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterafname.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zowel RNA-kwaliteit als kwantiteit kunnen negatief worden beïnvloed in alle stadia van de monstervoorbereiding, zoals weefsel manipulatie, LCM-proces en RNA-extractie. Daarom werd een LCM-protocol ontwikkeld om voldoende kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor latere genexpressie analyse.
Voor LCM gebruiken de meeste laboratoria secties 7 − 8 μm dik2. Dikkere secties zou toelaten om meer materiaal te oogsten. Echter, als ze te dik, dit kan de microscopische resolutie verm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Ute Zeitz en Nikole Ginner voor hun uitstekende technische hulp, evenals de Vetcore en dierenverzorging voor hun steun.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Referências
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M., Murray, G. I. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. , 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
