दवा से भरे लिपोसोम्स इंजेक्शन द्वारा लार्वा जेब्राफिश मैक्रोफेज के लिए दवाओं को लक्षित करना
Summary
यहां, हम मैक्रोफेज-वंश कोशिकाओं को दवा वितरण को लक्षित करने के उद्देश्य से दवा से भरे लिपोसोम और लार्वा जेब्राफिश में उनके माइक्रोइंजेक्शन के संश्लेषण का वर्णन करते हैं।
Abstract
जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)लार्वा मेजबान-रोगजनक बातचीत की जांच करने और उनके कार्यात्मक रूप से संरक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के कारण भड़काऊ रोग के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के योगदान के लिए एक लोकप्रिय मॉडल के रूप में विकसित हुआ है। वे भी व्यापक रूप से कैसे सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं विकास प्रक्रियाओं गाइड में मदद की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । लार्वा जेब्राफिश की ऑप्टिकल पारदर्शिता और आनुवंशिक ट्रैकेबिलिटी का लाभ उठाकर, ये अध्ययन अक्सर जीवित इमेजिंग दृष्टिकोण पर ध्यान केंद्रित करते हैं ताकि बरकरार जानवरों के भीतर फ्लोरोसेंटी चिह्नित मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल की कार्यात्मक रूप से विशेषता हो सके। रोग रोगजन्य में उनकी विविध कार्यात्मक विषमता और कभी-कभी विस्तार की भूमिकाओं के कारण, मैक्रोफेज को महत्वपूर्ण ध्यान मिला है। आनुवंशिक जोड़तोड़ के अलावा, रासायनिक हस्तक्षेप अब नियमित रूप से हेरफेर और लार्वा जेब्राफिश में मैक्रोफेज व्यवहार की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । इन दवाओं की डिलीवरी आमतौर पर प्रत्यक्ष विसर्जन या माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से मुफ्त दवा के निष्क्रिय लक्ष्यीकरण तक सीमित है। ये दृष्टिकोण इस धारणा पर भरोसा करते हैं कि मैक्रोफेज व्यवहार में कोई भी परिवर्तन मैक्रोफेज पर दवा के प्रत्यक्ष प्रभाव का परिणाम है, न कि किसी अन्य सेल प्रकार पर सीधे प्रभाव का डाउनस्ट्रीम परिणाम। यहां, हम दवा से भरे फ्लोरोसेंट लिपोसोम्स को माइक्रोइंजेक्ट करके विशेष रूप से लार्वा जेब्राफिश मैक्रोफेज के लिए दवाओं को लक्षित करने के लिए अपने प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम बताते हैं कि पोलोक्सामर 188-संशोधित दवा से भरे नीले फ्लोरोसेंट लिपोसोम को मैक्रोफेज द्वारा आसानी से लिया जाता है, न कि न्यूट्रोफिल द्वारा। हम इस बात के सबूत भी प्रदान करते हैं कि इस तरह से वितरित की गई दवाएं दवा की कार्रवाई के तंत्र के अनुरूप मैक्रोफेज गतिविधि को प्रभावित कर सकती हैं । यह तकनीक मैक्रोफेज के लिए दवाओं के लक्ष्यीकरण को सुनिश्चित करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए मूल्य की होगी और जब ड्रग्स विसर्जन जैसे पारंपरिक तरीकों से वितरित करने के लिए बहुत जहरीले हैं ।
Introduction
मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट सिस्टम रोगजनकों पर हमला करने के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है। इस प्रणाली में मोनोसाइट्स, मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाएं और मैक्रोफेज होते हैं, जो सक्रिय रूप से विदेशी रोगजनकों को फागोसाइटोज़ करते हैं, जिससे रोगजनक फैलते हैं। इन फागोसाइटिक और माइक्रोबिसिल प्रभावक कार्यों के अलावा, डेंड्रिटिक कोशिकाएं और मैक्रोफेज अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणालीकोसक्रिय करने के लिए साइटोकिन उत्पादन और एंटीजन-प्रस्तुति में भी सक्षम हैं। इन कोशिकाओं में से, मैक्रोफेज को उनकी विविध कार्यात्मक विषमता और कई भड़काऊ रोगों में शामिल होने के कारण विशेष ध्यान मिला है, ऑटोइम्युनिटी और संक्रामक रोगों सेकैंसर2,3,4,5,6,7तक। मैक्रोफेज की प्लास्टिसिटी और उनके ऊतक पर्यावरण की जरूरतों के अनुकूल होने की उनकी क्षमता को वीवो में इन कोशिकाओं का सीधे निरीक्षण और पूछताछ करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।
लार्वा जेब्राफिश एक आदर्श आदर्श जीव है जिसके द्वारा वीवो8में मैक्रोफेज के कार्य और प्लास्टिसिटी का अध्ययन करना है । लार्वा जेब्राफिश की ऑप्टिकल पारदर्शिता सीधे मैक्रोफेज के व्यवहार का पालन करने के लिए एक खिड़की प्रदान करती है, खासकर जब मैक्रोफेज-मार्किंग ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों के साथ मिलकर। लार्वा जेब्राफिश की लाइव इमेजिंग क्षमता और प्रायोगिक ट्रैकेबिलिटी का दोहन करने से मैक्रोफेज फ़ंक्शन में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त हुई हैं जिनकी मानव रोग9, 10,11,12,13,14,15की सीधी प्रासंगिकता है . इनमें से कई अध्ययनों ने जेब्राफिश में दवा गतिविधि के उच्च संरक्षण का लाभ भी उठाया है (एक विशेषता जो एक पूरे पशु दवा खोज मंच16,17,18के रूप में उनके उपयोग को रेखांकित करती है, औषधीय रूप से मैक्रोफेज फ़ंक्शन में हेरफेर करने के लिए रासायनिक हस्तक्षेपों का उपयोग करके। आज तक, इन औषधीय उपचारों को ज्यादातर विसर्जन के माध्यम से वितरित किया गया है, जिसके लिए दवा को पानी में घुलनशील होने की आवश्यकता होती है, या मुफ्त दवा के प्रत्यक्ष माइक्रोइंजेक्शन(चित्रा 1ए)द्वारा। इन निष्क्रिय वितरण रणनीतियों की सीमाओं में ऑफ-टारगेट प्रभाव और सामान्य विषाक्तता शामिल है जो मैक्रोफेज फ़ंक्शन पर किसी भी प्रभाव का आकलन करने में बाधा डाल सकती है। इसके अतिरिक्त, मैक्रोफेज पर दवा प्रभावों की जांच करते समय यह अज्ञात है कि क्या दवाएं स्वयं मैक्रोफेज पर या अधिक अप्रत्यक्ष तंत्र ों के माध्यम से कार्य कर रही हैं। मैक्रोफेज फ़ंक्शन की जांच करने के लिए इसी तरह के रासायनिक हस्तक्षेप अध्ययन करते समय, हमने माना कि विशेष रूप से मैक्रोफेज के लिए दवाओं को लक्षित करने के लिए एक सस्ती और सीधी डिलीवरी विधि विकसित करने की एक अपूरित आवश्यकता थी।
लिपोसोमसूक्ष्म, जैव संगत, लिपिड बाइलेयर्ड वेसिकल्स हैं जो प्रोटीन, न्यूक्लियोटाइड्स और ड्रग कार्गो19को समाहित कर सकते हैं। लिपोसोम्स की अनिलामेलर या मल्टीलामेलर लिपिड बाइलेयर संरचना एक जलीय आंतरिक ल्यूमेन बनाती है जहां पानी में घुलनशील दवाओं को शामिल किया जा सकता है जबकि हाइड्रोफोबिक दवाओं को लिपिड झिल्ली में एकीकृत किया जा सकता है। इसके अलावा, लाइपोसोम के भौतिक रासायनिक गुणों, जिसमें आकार, आवेश और सतह संशोधन शामिल हैं, को विशिष्ट कोशिकाओं20,21के लिए उनके लक्ष्यीकरण को दर्जी करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है। लिपोसोम्स की इन विशेषताओं ने उन्हें दवाएं पहुंचाने और वर्तमान उपचार आहार20की सटीकता बढ़ाने के लिए एक आकर्षक वाहन बनाया है । चूंकि लिपोसोम्स स्वाभाविक रूप से मैक्रोफेज द्वारा phagocytozed होते हैं (विशेष रूप से एब्लेशन प्रयोगों22के लिए मैक्रोफेज के लिए क्लोड्रेनाट वितरित करने में उनके नियमित उपयोग द्वारा शोषित एक विशेषता), वे मैक्रोफेज-विशिष्ट दवा वितरण(चित्र ा 1बी)के लिए एक आकर्षक विकल्प के रूप में उपस्थित हैं।
यह प्रोटोकॉल हाइड्रोफिलिक पॉलीमर पोलोक्सामर 188 के साथ लेपित ब्लू फ्लोरोसेंट लिपोसोम्स में दवाओं के निर्माण का वर्णन करता है, जो लिपोसोम सतह पर एक सुरक्षात्मक परत बनाता है और दवा प्रतिधारण को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है और बेहतर जैव अनुकूलता23है। पोलोक्समर को लिपोसोम्स की सतह कोटिंग के लिए चुना गया था क्योंकि हमारे पिछले शोध में दिखाया गया था कि, जब पॉलीथीन ग्लाइकोल संशोधित लिपोसोम्स की तुलना में, पोलोक्सामर संशोधित लिपोसोम्स ने23में नसों में नसों में रहने के बाद चूहों के पंजे और इसी तरह के फार्माकोकिनेटिक्स के चमड़े के इंजेक्शन के बाद बेहतर बायोकॉप्पपेंटिबिलिटी दिखाई । प्रोटोकॉल भी लार्वा जेब्राफिश में उनके माइक्रोइंजेक्शन के लिए वर्णित है और लाइव इमेजिंग उनके मैक्रोफेज लक्ष्यीकरण क्षमता और लिपोसोम क्षरण और साइटोप्लाज्मिक दवा वितरण के लिए आवश्यक इंट्रासेलुलर डिब्बों के लिए स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए । एक सबूत के रूप में अवधारणा हम पहले इस तकनीक का इस्तेमाल किया है मैक्रोफेज के लिए दो दवाओं को लक्षित करने के लिए तीव्र गाउटी सूजन24के एक लार्वा जेब्राफिश मॉडल में उनकी सक्रियता को दबाने के लिए । यह दवा वितरण तकनीक जेब्राफिश शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध रासायनिक “टूलकिट” का विस्तार करती है जो अपनी रुचि की दवाओं को मैक्रोफेज-लक्ष्यीकरण सुनिश्चित करना चाहते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हमने लार्वा जेब्राफिश में विशेष रूप से मैक्रोफेज को लक्षित करने के लिए दवा से भरे लिपोसोम तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया है। इस विधि का उपयोग विशेष रूप से मैक्रोफेज के लिए दवा?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सीजेएच (न्यूजीलैंड की स्वास्थ्य अनुसंधान परिषद और मार्सडन फंड, रॉयल सोसायटी ऑफ न्यूजीलैंड) और जेडडब्ल्यू (ऑकलैंड विश्वविद्यालय से संकाय अनुसंधान विकास कोष) को दिए गए अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक जेब्राफिश सुविधा के विशेषज्ञ प्रबंधन के लिए अलथा महगांवकर, बायोमेडिकल इमेजिंग रिसर्च यूनिट, स्कूल ऑफ मेडिकल साइंसेज, ऑकलैंड विश्वविद्यालय के साथ सहायता के लिए टीजी (mpeg1:EGFP) रिपोर्टर लाइन उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
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