Direcionando drogas para macrófagos de zebrafish larval injetando liposós carregados de drogas
Summary
Aqui, descrevemos a síntese de liposós carregados de drogas e sua microinjeção em zebrafish larval com o propósito de direcionar o fornecimento de drogas para células de linhagem de macrófagos.
Abstract
As larvas de zebrafish (Danio rerio) desenvolveram-se em um modelo popular para investigar interações hospedeiras-patógenas e a contribuição de células imunes inatas para doenças inflamatórias devido ao seu sistema imunológico inato funcionalmente conservado. Eles também são amplamente utilizados para examinar como as células imunes inatas ajudam a orientar os processos de desenvolvimento. Aproveitando a transparência óptica e a tratabilidade genética dos zebrafish larvais, esses estudos muitas vezes se concentram em abordagens de imagem ao vivo para caracterizar funcionalmente macrófagos e neutrófilos fluorescentes dentro de animais intactos. Devido à sua diversa heterogeneidade funcional e papéis em constante expansão na patogênese da doença, os macrófagos receberam atenção significativa. Além das manipulações genéticas, as intervenções químicas são usadas rotineiramente para manipular e examinar o comportamento do macrófago em zebrafish larval. A entrega dessas drogas é tipicamente limitada ao direcionamento passivo de drogas gratuitas através de imersão direta ou microinjeção. Essas abordagens dependem da suposição de que quaisquer alterações no comportamento do macrófago são resultado de um efeito direto da droga nos próprios macrófagos, e não uma consequência a jusante de um efeito direto em outro tipo de célula. Aqui, apresentamos nossos protocolos para direcionar drogas especificamente para macrófagos de zebrafish larval, microinjetando liposós fluorescentes carregados de drogas. Revelamos que liposomos fluorescentes azuis carregados de drogas modificadas por poloxamer 188 são prontamente tomados por macrófagos, e não por neutrófilos. Também fornecemos evidências de que drogas entregues dessa forma podem impactar a atividade do macrófago de forma consistente com o mecanismo de ação da droga. Essa técnica será de valor para os pesquisadores que desejam garantir o direcionamento de medicamentos aos macrófagos e quando as drogas são tóxicas demais para serem entregues por métodos tradicionais como a imersão.
Introduction
O sistema de phagócito mononuclear fornece uma primeira linha de defesa contra patógenos invasores. Este sistema consiste em monócitos, células e macrófagos derivados de monocitos, que ativamente fagocytoze patógenos estrangeiros, limitando assim a propagação de patógenos. Além dessas funções de efeito phagofítico e microbicida, células dendríticas e macrófagos também são capazes de produção de citocinas e apresentação de antígenos para ativar o sistema imunológico adaptativo1. Dessas células, os macrófagos têm recebido atenção especial devido à sua diversa heterogeneidade funcional e envolvimento em múltiplas doenças inflamatórias, desde autoimunidade e doenças infecciosas até câncer2,3,4,5,6,7. A plasticidade dos macrófagos e sua capacidade de se adaptar funcionalmente às necessidades de seu ambiente tecidual exigem abordagens experimentais para observar e interrogar diretamente essas células in vivo.
Zebrafish larval são um organismo modelo ideal pelo qual estudar a função e plasticidade dos macrófagos no vivo8. A transparência óptica do zebrafish larval fornece uma janela para observar diretamente o comportamento dos macrófagos, especialmente quando acoplado com linhas de repórtertransgênicas com marcação de macrófagos. Explorar o potencial de imagem ao vivo e a tratabilidade experimental de zebrafish larval levou a muitas percepções significativas sobre a função macrófaga que têm relevância direta para a doença humana9,10,11,12,13,14,15. Muitos desses estudos também se aproveitaram da alta conservação da atividade medicamentosa em zebrafish (atributo que sustenta seu uso como uma plataforma inteira de descoberta de drogas animais16,17,18), utilizando intervenções químicas para manipular farmacologicamente a função macrófago. Até o momento, esses tratamentos farmacológicos têm sido entregues principalmente através da imersão, o que exige que a droga seja solúvel em água, ou por microinjeção direta de droga gratuita(Figura 1A). Limitações dessas estratégias de entrega passiva incluem efeitos fora do alvo e toxicidade geral que podem impedir a avaliação de qualquer impacto na função do macrófago. Além disso, ao investigar efeitos medicamentosos em macrófagos não se sabe se as drogas estão agindo sobre os próprios macrófagos ou através de mecanismos mais indiretos. Ao realizar estudos semelhantes de intervenção química para investigar a função do macrófago, reconhecemos que havia uma necessidade não atendida de desenvolver um método de entrega barato e direto para direcionar medicamentos especificamente para macrófagos.
Liposomos são corículas microscópicas, biocompatíveis e lipídicas que podem encapsular proteínas, nucleotídeos e carga de drogas19. A estrutura de bicamadas lipídicas unilamelares ou multilémelares de liposomos forma um lúmen interno aquoso onde drogas solúveis em água podem ser incorporadas enquanto drogas hidrofóbicas podem ser integradas às membranas lipídicas. Além disso, as propriedades físicoquímicas dos liposomos, incluindo tamanho, carga e modificações de superfície podem ser manipuladas para adaptar seu direcionamento a células específicas20,21. Essas características dos liposomos tornaram-nos um veículo atraente para entregar medicamentos e melhorar a precisão dos regimes de tratamento atuais20. Como os liposós são naturalmente fagocytozed por macrófagos (um recurso explorado por seu uso rotineiro na entrega de clodronato especificamente para macrófagos para experimentos de ablação22), eles apresentam como uma opção atraente para a entrega de drogas específicas do macrófago(Figura 1B).
Este protocolo descreve a formulação de medicamentos em liposomos fluorescentes azuis revestidos com o poloxamer de polímero hidrofílico 188, que forma uma camada protetora na superfície liposome e tem sido mostrado para melhorar a retenção de drogas e ter biocompatibilidade superior23. Poloxamer foi escolhido para revestimento superficial de liposomos como nossa pesquisa anterior mostrou que, quando comparado com liposós modificados de polietileno glicol, liposomos modificados de poloxamer mostraram melhor biocompatibilidade após injeção subcutânea de patas de rato e farmacocinética semelhante em coelhos após infusão intravenosa23. Protocolos também são descritos para sua microinjeção em zebrafish larval e imagens vivas para avaliar sua capacidade de segmentação de macrófagos e localização para compartimentos intracelulares necessários para degradação liposome e entrega de drogas citoplasmáticas. Como prova de conceito, já usamos essa técnica para direcionar duas drogas aos macrófagos para suprimir sua ativação em um modelo de zebrafish larval de inflamação gouty aguda24. Esta técnica de entrega de drogas expande o “kit de ferramentas” químico disponível para pesquisadores de zebrafish que desejam garantir o direcionamento de macrófagos de suas drogas de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para formular liposós carregados de drogas para atingir especificamente macrófagos em zebrafish larval. Este método pode ser usado para dissecar o papel dos macrófagos em certos modelos da doença, garantindo a entrega direta direcionada de medicamentos especificamente aos macrófagos. Além disso, pode ser usado quando a toxicidade geral das drogas limita seu uso quando entregue por rotas mais convencionais, como a imersão. O protocolo descrito aqui fornece uma alternativa a …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios concedidos à C.J.H. (Conselho de Pesquisa em Saúde da Nova Zelândia e Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) e Z.W. (Fundo de Desenvolvimento de Pesquisa da Faculdade da Universidade de Auckland). Os autores agradecem a Alhad Mahagaonkar pela gestão especializada da instalação de zebrafish, a Unidade de Pesquisa em Imagens Biomédicas, a Escola de Ciências Médicas da Universidade de Auckland por assistência com imagens confocais e Graham Lieschke por presentear a linha de repórteres Tg(mpeg1:EGFP).
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
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