Her beskriver vi syntesen af narkotikabelastede liposomer og deres mikroinjektion i larvezebrafisk med det formål at målrette lægemiddellevering til makrofag-afstamning celler.
Zebrafisk(Danio rerio)larver har udviklet sig til en populær model til at undersøge host-patogen interaktioner og bidraget fra medfødte immunceller til inflammatorisk sygdom på grund af deres funktionelt bevarede medfødte immunsystem. De er også meget udbredt til at undersøge, hvordan medfødte immunceller hjælpe guide udviklingsmæssige processer. Ved at drage fordel af den optiske gennemsigtighed og genetiske tractability af larve zebrafisk, disse undersøgelser ofte fokusere på levende billeddannelse tilgange til funktionelt karakterisere fluorescerende markerede makrofager og neutrofiler i intakte dyr. På grund af deres forskelligartede funktionelle heterogenitet og stadigt voksende roller i sygdompatogenese, makrofager har fået betydelig opmærksomhed. Ud over genetiske manipulationer, kemiske indgreb er nu rutinemæssigt bruges til at manipulere og undersøge makrofag adfærd i larve zebrafisk. Levering af disse stoffer er typisk begrænset til passiv målretning af gratis stof gennem direkte nedsænkning eller mikroinjektion. Disse tilgange er afhængige af den antagelse, at eventuelle ændringer i makrofag adfærd er resultatet af en direkte effekt af lægemidlet på makrofager selv, og ikke en downstream konsekvens af en direkte effekt på en anden celle type. Her præsenterer vi vores protokoller for målretning af lægemidler specifikt til larve zebrafisk makrofager ved microinjecting stof-loaded fluorescerende liposomer. Vi afslører, at poloxamer 188-modificerede stof-loaded blå fluorescerende liposomer er let taget op af makrofager, og ikke af neutrofiler. Vi fremlægger også bevis for, at lægemidler leveret på denne måde kan påvirke makrofagaktivitet på en måde, der er i overensstemmelse med stoffets virkningsmekanisme. Denne teknik vil være af værdi for forskere, der ønsker at sikre målretning af lægemidler til makrofager, og når narkotika er for giftige til at blive leveret ved traditionelle metoder som nedsænkning.
Den mononukleare fagocyt system giver en første linje i forsvaret mod invaderende patogener. Dette system består af monocytter, monocyt-afledte dendritiske celler og makrofager, som aktivt fagocytoze udenlandske patogener, hvilket begrænser patogenspredning. Ud over disse fagocytiske og mikrobiske effektor funktioner, dendritiske celler og makrofager er også i stand til cytokin produktion og antigen-præsentation for at aktivere adaptive immunsystem1. Af disse celler, makrofager har fået særlig opmærksomhed på grund af deres forskelligartede funktionelle heterogenitet og engagement i flere inflammatoriske sygdomme, fra autoimmune og smitsomme sygdomme til kræft2,3,4,5,6,7. Makrofagers plasticitet og deres evne til funktionelt at tilpasse sig behovene i deres vævsmiljø kræver eksperimentelle tilgange til direkte at observere og afhøre disse celler in vivo.
Larve zebrafisk er en ideel model organisme til at studere funktionen og plasticitet makrofager i vivo8. Den optiske gennemsigtighed af larve zebrafisk giver et vindue til direkte at observere adfærd makrofager, især når kombineret med makrofag-mærkning transgene reporter linjer. Udnyttelse af larvezebrafisks live billeddannelsespotentiale og eksperimentelle tractability har ført til mange væsentlige indsigter i makrofagsfunktion , der har direkte relevans for sygdomme hos mennesker9,10,11,12,13,14,15. Mange af disse undersøgelser har også benyttet sig af den høje bevarelse af narkotikaaktivitet i zebrafisk (en egenskab, der understøtter deres anvendelse som en hel dyr drug discovery platform16,17,18), ved at udnytte kemiske indgreb til farmakologisk manipulere makrofag funktion. Til dato, disse farmakologiske behandlinger er for det meste blevet leveret enten gennem nedsænkning, som kræver, at stoffet skal være vandopløseligt, eller ved direkte mikroinjektion af gratis stof(figur 1A). Begrænsninger af disse passive leveringsstrategier omfatter off-target effekter og generel toksicitet, der kan udelukke at vurdere enhver indvirkning på makrofag funktion. Derudover, når man undersøger narkotika effekter på makrofager er det uvist, om narkotika handler på makrofager selv eller gennem mere indirekte mekanismer. Når vi udfører lignende kemiske indgreb undersøgelser for at undersøge makrofag funktion, vi erkendte, at der var et udækket behov for at udvikle en billig og ligetil leveringsmetode til at målrette lægemidler specifikt til makrofager.
Liposomer er mikroskopiske, biokompatible, lipid tolagede vesikler, der kan indkapsle proteiner, nukleotider og narkotika last19. Den unilamellar eller multilamellar lipid tolags struktur liposomer danner en vandig indre lumen, hvor vandopløselige lægemidler kan indarbejdes, mens hydrofobe lægemidler kan integreres i lipid membraner. Desuden kan de fysisk-kemiske egenskaber liposomer, herunder størrelse, opladning og overflade ændringer manipuleres til at skræddersy deres målretning til specifikke celler20,21. Disse funktioner i liposomer har gjort dem til et attraktivt middel til at levere narkotika og øge præcisionen af de nuværende behandlingsregimer20. Som liposomer er naturligt fagocytozed af makrofager (en funktion udnyttes ved deres rutinemæssige brug i at levere clodronate specifikt til makrofager til ablation eksperimenter22),de præsenterer som en attraktiv mulighed for makrofag-specifikke stof levering(Figur 1B).
Denne protokol beskriver formuleringen af lægemidler i blå fluorescerende liposomer belagt med hydrofile polymer poloxamer 188, der danner et beskyttende lag på liposom overfladen og har vist sig at forbedre opbevaring af lægemidler og har overlegen biokompatibilitet23. Poloxamer blev valgt til overfladebelægning af liposomer som vores tidligere forskning havde vist, at sammenlignet med polyethylenglycol modificeret liposomer, poloxamer modificerede liposomer viste bedre biokompatibilitet efter subkutan injektion af rotte poter og lignende farmakokinetik hos kaniner efter intravenøs infusion23. Protokoller er også beskrevet for deres mikroinjektion i larve zebrafisk og levende billeddannelse til at vurdere deres makrofag-målretning evne og lokalisering til intracellulære rum er nødvendige for liposom nedbrydning og cytoplasmatisk stof levering. Som et proof-of-concept har vi tidligere brugt denne teknik til at målrette to lægemidler til makrofager at undertrykke deres aktivering i en larve zebrafisk model af akut gigt inflammation24. Dette stof levering teknik udvider den kemiske “værktøjskasse” til rådighed for zebrafisk forskere, der ønsker at sikre makrofag-målretning af deres lægemidler af interesse.
Her har vi givet en detaljeret protokol til at formulere narkotika-loaded liposomer til specifikt at målrette makrofager i larve zebrafisk. Denne metode kan bruges til at dissekere makrofagers rolle i visse sygdomsmodeller ved at sikre direkte målrettet levering af lægemidler specifikt til makrofager. Desuden kan det bruges, når generel toksicitet af narkotika begrænser deres anvendelse, når de leveres af mere konventionelle ruter, som nedsænkning. Den protokol, der er beskrevet her, er et alternativ til andre nan…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud til C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) og Z.W. (Faculty Research Development Fund from the University of Auckland). Forfatterne takker Alhad Mahagaonkar for ekspertledelse af zebrafisk facilitet, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland for bistand med konfokale billeddannelse og Graham Lieschke for gaver Tg (mpeg1: EGFP) reporter linje.
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
micromanipulator | Narishige | M-152 | |
mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
water bath | |||
Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |