薬物を含むリポソームを注射してラーバルゼブラフィッシュマクロファージに薬物を標的にする
Summary
ここでは、マクロファージ系細胞への薬物送達を標的とする目的で、薬物を含むリポソームの合成と幼虫ゼブラフィッシュへのマイクロ注入について説明する。
Abstract
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)幼虫は、宿主と病原体の相互作用と、機能的に保存された自然免疫系による炎症性疾患への自然免疫細胞の寄与を調べる一般的なモデルに発展した。彼らはまた、自然免疫細胞が発達プロセスを導くのにどのように役立つかを調べるために広く使用されています。幼虫ゼブラフィッシュの光学的透明性と遺伝的なトラクタビリティを利用して、これらの研究は、多くの場合、無傷の動物内の蛍光マークマクロファージおよび好中球を機能的に特徴付けるためのライブイメージングアプローチに焦点を当てています。その多様な機能の異質性と病気の病因の役割が拡大し続けているため、マクロファージは大きな注目を集めています。遺伝子操作に加えて、化学介入は現在、幼虫ゼブラフィッシュのマクロファージ挙動を操作し、調べるために日常的に使用されています。これらの薬物の送達は、典型的には、直接浸漬またはマイクロインジェクションを介して遊離薬物の受動的標的に限定される。これらのアプローチは、マクロファージ行動の変化は、マクロファージ自体に対する薬物の直接的な影響の結果であり、別の細胞タイプに対する直接的な影響の下流の結果ではないという仮定に依存する。ここでは、薬物を含む蛍光リポソームをマイクロ注入することにより、特に幼虫ゼブラフィッシュマクロファージを標的とする薬剤を標的とするプロトコルを紹介します。ポロクサマー188変性薬物搭載青色蛍光リポソームは、好中球ではなくマクロファージによって容易に取り込まれる。我々はまた、このように送達された薬物が薬物の作用機序と一致する方法でマクロファージ活性に影響を与える可能性があるという証拠を提供する。この技術は、マクロファージへの薬物の標的化を確実にしたい研究者や、薬物が毒性が高すぎて浸漬のような伝統的な方法で提供できない場合に価値があります。
Introduction
単核食細胞システムは、侵入病原体に対する防御の第一線を提供する。このシステムは、単球由来の樹状細胞とマクロファージから構成され、外来病原体を積極的に貪食し、病原体の広がりを制限します。これらの貪食作用および微小網エフェクター機能に加えて、樹状細胞およびマクロファージは、サイトカイン産生および抗原提示が適応免疫系を活性化することも可能である1。これらの細胞のうち、マクロファージは、自己免疫や感染症から癌にまで、多くの炎症性疾患に関与する多様な機能の不均一性および関与のために特に注目されている2、3、4、5、6、7。マクロファージの可塑性と組織環境に対するニーズに機能的に適応する能力は、これらの細胞を生体内で直接観察し、尋問するための実験的アプローチを必要とする。
ラーバルゼブラフィッシュは、インビボ8でマクロファージの機能と可塑性を研究するための理想的なモデル生物である。幼虫ゼブラフィッシュの光学的透明性は、特にマクロファージマーキングトランスジェニックレポーターラインと組み合わせた場合に、マクロファージの挙動を直接観察するウィンドウを提供します。生画像化の可能性と幼虫ゼブラフィッシュの実験のトラクチャビリティを利用することは、ヒト疾患9、10、11、12、13、14、15に直接関連するマクロファージ機能に関する多くの重要な洞察を導いた。これらの研究の多くは、ゼブラフィッシュにおける薬物活性の高い保全(動物創薬プラットフォーム16、17、18)としての使用を支える属性)を利用して、薬理学的にマクロファージ機能を操作するための化学的介入を利用している。現在までに、これらの薬理学的治療は、主に水溶性である薬剤を必要とする浸漬、または遊離薬物の直接マイクロ注射によって提供されてきた(図1A)。これらの受動デリバリー戦略の限界には、マクロファージ機能への影響を評価することを妨げる可能性のあるオフターゲット効果および一般的な毒性が含まれる。さらに、 マクロファージに対する薬物の影響を調べる場合、薬物がマクロファージ自体に作用しているのか、それともより間接的なメカニズムを通じて作用しているのかは不明である。マクロファージ機能を調べるのに同様の化学的介入研究を行う際に、マクロファージに特異的に薬物を標的とする安価で簡単な送達方法を開発する必要はないと認識した。
リポソームは、顕微鏡、生体適合性、脂質二重層小胞であり、タンパク質、ヌクレオチドおよび薬物貨物19をカプセル化することができる。リポソームのユニラメラまたはマルチラメラ脂質二重層構造は水溶性薬物を組み込むことができる水性内腔を形成し、一方で疎水性薬物を脂質膜に組み込むことができる。さらに、サイズ、電荷および表面修飾を含むリポソームの物理化学的特性は、それらの標的を特定の細胞20、21に合わせて調整するように操作することができる。リポソームのこれらの特徴は、彼らに薬剤を提供し、現在の治療レジメン20の精度を高めるための魅力的な車両を作りました。リポソームはマクロファージによって自然に貪食される(アブレーション実験22のためにマクロファージにクロドロナートを送達する際の日常的な使用によって利用される特徴)、マクロファージ特異的薬物送達のための魅力的な選択肢として提示される(図1B)。
このプロトコルは、親水性ポリマーポロクサマー188でコーティングされた青色蛍光リポソームへの薬物の製剤を記述し、リポソーム表面に保護層を形成し、薬物保持性を高め、優れた生体適合性23を有することが示されている。ポロクサマーは、我々の以前の研究としてリポソームの表面コーティングのために選ばれた、ポリエチレングリコール修飾リポソームと比較すると、ポロクサマー修飾リポソームは、点滴注入後のウサギの注射におけるラット足および類似の薬物動態の皮下に続くより良い生体適合性を示した23。また、プロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュへのマイクロインジェクションとライブイメージングについても説明され、リポソームの分解や細胞質学的薬物送達に必要な細胞内コンパートメントへのマクロファージターゲターゲの能力と局在性を評価します。概念実証として、我々は以前に急性痛風炎症の幼虫ゼブラフィッシュモデルで彼らの活性化を抑制するためにマクロファージに2つの薬物を標的にこの技術を使用しました24.この薬物送達技術は、関心のある薬物のマクロファージターゲを確実にしたいゼブラフィッシュの研究者が利用できる化学的「ツールキット」を拡大する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、幼虫ゼブラフィッシュのマクロファージを特異的に標的とする薬物搭載リポソームを処方する詳細なプロトコルを提供しました。この方法は、特定の疾患モデルにおけるマクロファージの役割を解剖するために、特にマクロファージに対する薬物の直接的な標的送達を保証することによって使用することができる。さらに、薬物の一般的な毒性が浸漬のようなより従来の経路によ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、C.J.H.(ニュージーランド健康研究評議会、ニュージーランド王立協会マースデン基金)とZ.W.(オークランド大学の教員研究開発基金)に授与された助成金によって支えられました。著者らは、ザルハド・マハガオンカールに対し、ゼブラフィッシュ施設の専門家管理、オークランド大学医学部生物医学イメージング研究ユニットに対し、共焦点イメージングの支援を行い、グラハム・リーシュケがTg(mpeg1:EGFP)記者ラインを贈呈してくれたことに感謝している。
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
Referências
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