약물이 탑재된 리포좀을 주입하여 애벌레 얼룩말 대식세포에 약물을 타겟팅
Summary
여기서, 우리는 대식세포 혈통 세포에 대한 약물 전달을 표적으로 하기 위한 목적으로 약물로드 리포좀과 그들의 미세 주입을 애벌레 얼룩말어로 합성하는 것을 기술한다.
Abstract
Zebrafish(Danio rerio)유충은 기능적으로 보존된 선천적 면역 계통으로 인해 염증성 질환에 대한 항성 병원체 상호 작용 및 선천성 면역 세포의 기여를 조사하는 인기있는 모델로 개발되었습니다. 그(것)들은 또한 선천적인 면역 세포가 발달 과정을 인도하는 것을 어떻게 돕기 위하여 검토하기 위하여 널리 이용됩니다. 애벌레 얼룩말피시의 광학 투명성 및 유전적 견인성을 활용함으로써, 이러한 연구는 종종 기능적으로 형광으로 표시된 대식세포와 호중구를 그대로 동물 내에서 특성화하는 라이브 이미징 접근법에 초점을 맞춥니다. 다양한 기능성 이질성과 질병 발병기전에서 끊임없이 확장되는 역할로 인해 대식세포는 상당한 주목을 받고 있습니다. 유전자 조작 이외에, 화학적 개입은 지금 애벌레 얼룩말물고기에 있는 대식세포 행동을 조작하고 검토하기 위하여 일상적으로 이용됩니다. 이들 약물의 전달은 전형적으로 직접 침지 또는 미세 주입을 통한 자유 약물의 수동 표적화로 제한된다. 이러한 접근법은 대식세포 거동에 대한 모든 변화가 대식세포 자체에 대한 약물의 직접적인 영향의 결과이며 다른 세포 유형에 직접적인 영향을 미치는 다운스트림 결과가 아니라는 가정에 의존합니다. 여기에서는 약물로드 형광 리포좀을 마이크로 주입하여 애벌레 제브라피시 대식세포에 대한 표적화 약물을 대상으로 하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 poloxamer 188 개량한 약 로드된 청색 형광 리포좀이 호중구가 아니라 대식세포에 의해 쉽게 채택된다는 것을 밝힙니다. 우리는 또한 이 방법으로 전달된 약이 약물의 작용 기계장치와 일치하는 방식으로 대식세포 활동에 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공합니다. 이 기술은 대식세포에 약물의 표적을 보장하고자하는 연구자와 약물이 침수와 같은 전통적인 방법에 의해 전달되기에 너무 독성이있을 때 가치가있을 것입니다.
Introduction
단핵 식세포 시스템은 침입 병원균에 대한 첫 번째 방어선을 제공합니다. 이 시스템은 단핵구, 단핵구 유래 수지상 세포 및 대식세포로 구성되어 있으며, 이는 적극적으로 외래 병원균을 식균화하여 병원균 확산을 제한합니다. 이러한 식균 및 미생물 이펙터 기능 이외에, 수지상 세포 및 대식세포는 또한 적응형 면역 계통을 활성화시키기 위해 사이토카인 생산 및 항원-프리젠테이션이 가능하다1. 이들 세포 중 대식세포는 자가면역 및 감염성 질환에서암2,3,4,5,6,7에이르는 다양한 기능적 이질성 및 다중 염증성 질환에 의한 참여로 인해 특별한 주목을 받고 있다. 대식세포의 가소성과 기능적으로 그들의 조직 환경에 대한 요구에 적응하는 능력은 생체 내에서 이 세포를 직접 관찰하고 심문하는 실험적인 접근법을 필요로 합니다.
애벌레 얼룩말은 생체 내 대식세포의 기능과 가소성을 연구하는 이상적인 모델 유기체이다8. 애벌레 제브라피시의 광학 투명성은 대식세포의 동작을 직접 관찰할 수 있는 창을 제공하며, 특히 대식세포 표시 형질전환 리포터 라인과 결합될 때 더욱 이같이 말합니다. 애벌레 제브라피시의 살아있는 이미징 전위 및 실험적 견인력을 이용하는것은 인간 질병9,10,11, 12,13,14,15와직접적인 관련이 있는 대식세포 기능에 대한 많은 중요한 통찰력을 이끌어 내고 있다. 이러한 연구의 대부분은 또한 제브라피시의 약물 활성의 높은 보존을 활용하고있다 (전체 동물 약물 발견 플랫폼으로 자신의 사용을 뒷받침하는 속성16,17,18),약리학적으로 대식세포 기능을 조작하는 화학 적 개입을 활용하여. 현재까지, 이러한 약리학적 치료는 대부분 침수를 통해 전달되어 왔으며, 이는 수용성 약물을 요구하거나, 또는 자유 약물의 직접 미세 주입에 의해(그림 1A). 이러한 수동 전달 전략의 한계는 대식 세포 기능에 미치는 영향을 평가 하는 것을 배제할 수 있는 오프 대상 효과 및 일반적인 독성을 포함 합니다. 또한, 대 식 세포에 약물 효과 조사 할 때 그것은 약물 이 대식 세포 자체에 행동 또는 더 간접 적인 메커니즘을 통해 알 수 없습니다. 대식세포 기능을 조사하기 위해 유사한 화학 적 개입 연구를 수행 할 때, 우리는 대식 세포에 특별히 약물을 대상으로 저렴하고 간단한 전달 방법을 개발하는 충족되지 않은 필요성이 있음을 인식했다.
리포솜은 단백질, 뉴클레오티드 및 약물화물(19)을캡슐화할 수 있는 현미경, 생체 적합성, 지질 이중층 소포이다. 리포좀의 단일 또는 다층 지질 이중층 구조는 수용성 약물이 통합될 수 있는 수성 내부 루멘을 형성하고 소수성 약물은 지질 막에 통합될 수 있습니다. 또한, 크기, 전하 및 표면 변형을 포함하는 리포좀의 물리화학적 특성은 특정세포(20,21)에그들의 표적화를 맞춤화하도록 조작될 수 있다. 리포솜의 이러한 특징은 그들에게 약물을 전달하고 현재 치료 요법20의정밀도를 향상시키는 매력적인 차량으로 만들었습니다. 리포솜은 대식세포에 의해 자연적으로 식세포화(절제 실험을 위한 대식세포에 특이적으로 클로드로네이트를 전달하는 데 일상적인 사용에 의해 악용되는 특징22),그들은 대식세포 특이적 약물 전달을 위한 매력적인 옵션으로 제시한다(그림1B).
이 프로토콜은 친수성 폴리머 폴록사머(188)로 코팅된 청색 형광 지질종으로 약물의 제형을 설명하고, 이는 리포솜 표면에 보호층을 형성하고 약물 보유를 향상시키고 우수한 생체적합성(23)을갖는다는 것을 나타내었다. 폴록사머는 우리의 이전 연구에서 리포솜의 표면 코팅을 위해 선택되었다, 폴리에틸렌 글리콜 수정 리포좀에 비해, 폴록사머 수정 리포좀은 정맥 주입 다음 토끼에 쥐 발 및 유사한 약동학의 피하 주입 다음 더 나은 생체 적합성을 보였다23. 프로토콜은 또한 유충 제브라피시및 살아있는 이미징으로 의학적 주사를 위해 설명되어 리포좀 분해 및 세포질 약물 전달에 필요한 세포내 구획에 대한 대식세포 표적화 능력 및 국소화를 평가합니다. 개념 증명으로 우리는 이전에 급성 gouty 염증(24)의애벌레 얼룩말 모델에서 자신의 활성화를 억제하기 위해 대식세포에 두 약물을 대상으로이 기술을 사용했다. 이 약물 전달 기술은 관심 있는 약물의 대식세포 타겟팅을 보장하고자 하는 제브라피시 연구원들이 사용할 수 있는 화학 “툴킷”을 확장합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 우리는 애벌레 얼룩말물고기에 있는 대식세포를 구체적으로 표적으로 하기 위하여 약 로드한 리포좀을 공식화하는 상세한 프로토콜을 제공했습니다. 이 방법은 특정 질병 모델에서 대식세포의 역할을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 약물의 일반적인 독성이 침수와 같은 보다 전통적인 경로에 의해 전달될 때 그들의 사용을 제한할 때 사용될 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 C.J.H. (뉴질랜드와 마스덴 기금의 건강 연구 위원회, 뉴질랜드 왕립 학회) 및 Z.W. (오클랜드 대학에서 교수 연구 개발 기금)에 수여 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 제브라피시 시설의 전문가 관리를 위한 Alhad Mahagaonkar, 생물 의학 화상 진찰 연구 단위, 의학 과학의 학교, 공초점 화상 진찰을 가진 원조를 위한 오클랜드 대학 및 Tg (mpeg1:EGFP) 기자 라인을 선물을 위한 그레이엄 리슈케에게 감사드립니다.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
Referências
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