Målretting narkotika til Larval Zebrafish Macrophages ved å injisere narkotika-lastet liposomer
Summary
Her beskriver vi syntesen av legemiddelbelastede liposomer og deres mikroinjeksjon i larvesebrafisk med det formål å målrette narkotikalevering til makrofag-avstamningceller.
Abstract
Sebrafisk (Danio rerio) larver har utviklet seg til en populær modell for å undersøke host-patogeninteraksjoner og bidrag et medfødt immunceller til inflammatorisk sykdom på grunn av deres funksjonelt bevarte medfødte immunsystem. De er også mye brukt til å undersøke hvordan medfødte immunceller bidrar til å veilede utviklingsprosesser. Ved å dra nytte av den optiske gjennomsiktigheten og genetiske tractability av larval sebrafisk, fokuserer disse studiene ofte på levende bildetilnærminger for å funksjonelt karakterisere fluorescerende merkede makrofager og nøytrofiler i intakte dyr. På grunn av deres mangfoldige funksjonelle heterogenitet og stadig voksende roller i sykdomspatogenese, har makrofager fått betydelig oppmerksomhet. I tillegg til genetiske manipulasjoner brukes kjemiske intervensjoner nå rutinemessig til å manipulere og undersøke makrofagatferd i larvalsebrafisk. Levering av disse stoffene er vanligvis begrenset til passiv målretting av gratis stoff gjennom direkte nedsenking eller mikroinjeksjon. Disse tilnærmingene er avhengige av antagelsen om at eventuelle endringer i makrofagatferd er et resultat av en direkte effekt av stoffet på makrofagene selv, og ikke en nedstrøms konsekvens av en direkte effekt på en annen celletype. Her presenterer vi våre protokoller for målretting av legemidler spesielt til larvesebrafisk makrofager ved mikrosprøytende legemiddelbelastede fluorescerende liposomer. Vi avslører at poloxamer 188-modifiserte narkotika-lastet blå fluorescerende liposomer er lett tatt opp av makrofager, og ikke av nøytrofiler. Vi gir også bevis for at legemidler levert på denne måten kan påvirke makrofagaktivitet på en måte som er i samsvar med virkningsmekanismen til stoffet. Denne teknikken vil være av verdi for forskere som ønsker å sikre målretting av legemidler til makrofager og når narkotika er for giftige til å bli levert av tradisjonelle metoder som nedsenking.
Introduction
Det enukleære phagocyte-systemet gir en første forsvarslinje mot invaderende patogener. Dette systemet består av monocytter, monocytt-avledede dendrittiske celler og makrofager, som aktivt fagocytoze utenlandske patogener, og dermed begrense patogenspredning. I tillegg til disse fagocytiske og mikrobicidale effektorfunksjonene er dendrittiske celler og makrofager også i stand til cytokinproduksjon og antigenpresentasjon for å aktivere det adaptive immunsystemet1. Av disse cellene har makrofager fått spesiell oppmerksomhet på grunn av deres mangfoldige funksjonelle heterogenitet og involvering i flere inflammatoriske sykdommer, fra autoimmunitet og smittsomme sykdommer til kreft2,3,4,5,6,7. Plastisiteten til makrofager og deres evne til å funksjonelt tilpasse seg behovene til vevsmiljøet, krever eksperimentelle tilnærminger for å direkte observere og avhøre disse cellene i vivo.
Larval sebrafisk er en ideell modell organisme for å studere funksjonen og plastisiteten til makrofager in vivo8. Den optiske gjennomsiktigheten til larvalsebrafisk gir et vindu for å direkte observere oppførselen til makrofager, spesielt når de er kombinert med makrofag-merking transgene reporterlinjer. Utnytte live imaging potensial og eksperimentell elimive tractability av larval sebrafisk har ført til mange betydelig innsikt i makrofag funksjon som har direkte relevans for menneskelig sykdom9,10,11,12,13,14,15. Mange av disse studiene har også benyttet seg av høy bevaring av narkotikaaktivitet i sebrafisk (et attributt som underbygger deres bruk som en hel dyrenarkotikaoppdagelsesplattform16,17,18), ved å utnytte kjemiske intervensjoner til farmakologisk manipulere makrofagfunksjon. Til dags dato har disse farmakologiske behandlingene for det meste blitt levert enten gjennom nedsenking, noe som krever at stoffet er vannløselig, eller ved direkte mikroinjeksjon av fritt legemiddel (figur 1A). Begrensninger i disse passive leveringsstrategiene inkluderer off-target effekter og generell toksisitet som kan utelukke å vurdere eventuelle innvirkning på makrofagfunksjon. I tillegg, når du undersøker narkotikaeffekter på makrofager, er det ukjent om stoffene handler på makrofagene selv eller gjennom mer indirekte mekanismer. Når vi utfører lignende kjemiske intervensjonsstudier for å undersøke makrofagfunksjon, innså vi at det var et udekket behov for å utvikle en billig og grei leveringsmetode for å målrette narkotika spesielt mot makrofager.
Liposomer er mikroskopiske, biokompatible, lipid tolagsvesikler som kan innkapsle proteiner, nukleotider og legemiddellast19. Unilamellar eller multilamellær lipid bilayer struktur av liposomer danner en vandig indre lumen der vannløselige legemidler kan innlemmes mens hydrofobe legemidler kan integreres i lipidmembraner. I tillegg kan de fysikokjemiske egenskapene til liposomer, inkludert størrelse, ladning og overflatemodifikasjoner manipuleres for å skreddersy målrettingen til bestemte celler20,21. Disse funksjonene av liposomer har gjort dem til et attraktivt kjøretøy for å levere narkotika og forbedre presisjonen av dagens behandlingsregimer20. Som liposomer er naturlig phagocytozed av makrofager (en funksjon utnyttet av deres rutinemessigbruk i å levere clodronate spesielt til makrofager for ablasjon eksperimenter22), de presenterer som et attraktivt alternativ for makrofag-spesifikk narkotikalevering (Figur 1B).
Denne protokollen beskriver formuleringen av legemidler i blå fluorescerende liposomer belagt med hydrofile polymer poloxamer 188, som danner et beskyttende lag på liposom overflaten og har vist seg å forbedre stoffet oppbevaring og har overlegen biokompatibilitet23. Poloxamer ble valgt for overflatebelegg av liposomer som vår tidligere forskning hadde vist at sammenlignet med polyetylenglykol modifisertliposomer, poloxamer modifisertliposomer viste bedre biokompatibilitet etter subkutan injeksjon av rottepoter og lignende farmakokinetikk hos kaniner etter intravenøs infusjon23. Protokoller er også beskrevet for deres mikroinjeksjon i larval sebrafisk og levende bildebehandling for å vurdere deres makrofag-målretting evne og lokalisering til intracellulære rom som er nødvendige for liposom nedbrytning og cytoplasmatisk narkotikalevering. Som et konseptbevis har vi tidligere brukt denne teknikken til å målrette to legemidler til makrofager for å undertrykke aktiveringen i en larvesebrafiskmodell av akutt giktisk betennelse24. Denne legemiddelleveringsteknikken utvider den kjemiske “verktøykassen” som er tilgjengelig for sebrafiskforskere som ønsker å sikre makrofag-målretting av sine legemidler av interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi gitt en detaljert protokoll for å formulere legemiddelbelastede liposomer for å spesifikt målrette makrofager i larvalsebrafisk. Denne metoden kan brukes til å dissekere makrofagenes rolle i visse sykdomsmodeller ved å sikre direkte målrettet levering av legemidler spesielt til makrofager. Videre kan det brukes når generell toksisitet av narkotika begrenser bruken når de leveres av mer konvensjonelle ruter, som nedsenking. Protokollen som er beskrevet her, gir et alternativ til andre nanopartikler som …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd tildelt C.J.H. (Health research Council of New Zealand og Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) og Z.W. (Faculty Research Development Fund fra University of Auckland). Forfatterne takker Alhad Mahagaonkar for ekspertstyring av sebrafiskanlegget, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland for hjelp med confocal imaging og Graham Lieschke for å gi tg (mpeg1:EGFP) reporterlinje.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
Referências
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers–liposomes and microspheres–on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Pesquisa do Câncer. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
