Ориентация наркотиков на Larval Зебрафиш Макрофагс путем инъекций наркотиков загруженных липосом
Summary
Здесь мы описываем синтез нагруженных наркотиками липосом и их микроинъекцию в личинок зебры с целью таргетинга доставки лекарств в клетки макрофаговой.
Abstract
Зебрафиш (Danio rerio) личинки превратились в популярную модель для исследования принимающих патогенных взаимодействий и вклад врожденных иммунных клеток к воспалительным заболеваниям из-за их функционально сохраненной врожденной иммунной системы. Они также широко используются для изучения того, как врожденные иммунные клетки помогают направлять процессы развития. Воспользовавшись оптической прозрачностью и генетической усвоcargo личинок зебры, эти исследования часто сосредоточены на живых подходов к визуализации, чтобы функционально охарактеризовать флуоресцентно отмеченные макрофаги и нейтрофилы внутри нетронутых животных. Благодаря своей разнообразной функциональной неоднородности и постоянно расширяющейся роли в патогенезах болезней, макрофагу уделяется значительное внимание. В дополнение к генетическим манипуляциям, химические вмешательства в настоящее время регулярно используются для манипулирования и изучения поведения макрофагов у личинок зебры. Доставка этих препаратов, как правило, ограничивается пассивным таргетингом свободных лекарств путем прямого погружения или микроинъекции. Эти подходы опираются на предположение, что любые изменения в поведении макрофагов являются результатом прямого воздействия препарата на сами макрофаги, а не следствием прямого воздействия на другой тип клеток. Здесь мы представляем наши протоколы для ориентации наркотиков специально для личинки зебры макрофагов микроинъекционных наркотиков загруженных флуоресцентных липосом. Мы показываем, что полоксамер 188-модифицированные снижаемые синюю флуоресцентную липосомы легко подхвачены макрофагами, а не нейтрофиловами. Мы также предоставляем доказательства того, что лекарства, поставляемые таким образом, могут влиять на активность макрофагов в соответствии с механизмом действия препарата. Этот метод будет иметь значение для исследователей, желающих обеспечить ориентации наркотиков на макрофаги и когда наркотики слишком токсичны, чтобы быть доставлены традиционными методами, как погружение.
Introduction
Моноядерная фагоцитовая система обеспечивает первую линию защиты от вторжения патогенов. Эта система состоит из моноцитов, моноцитов дендритных клеток и макрофагов, которые активно фагоцитируют чужеродные патогены, тем самым ограничивая распространение патогенов. В дополнение к этим функциям фагоцитарного и микробицидного эффектора, дендритные клетки и макрофаги также способны к производству цитокинов и антиген-презентации для активации адаптивной иммунной системы1. Из этих клеток макрофаги получили особое внимание благодаря своей разнообразной функциональной неоднородности и вовлеченности в множественные воспалительные заболевания, от аутоиммунных и инфекционных заболеваний до рака2,3,4,5,7. Пластичность макрофагов и их способность функционально адаптироваться к потребностям их тканей окружающей среды требует экспериментальных подходов непосредственно наблюдать и допрашивать эти клетки in vivo.
Larval зебрафиш являются идеальной моделью организма, с помощью которого для изучения функции и пластичности макрофагов in vivo8. Оптическая прозрачность личиночных зебры обеспечивает окно для непосредственного наблюдения за поведением макрофагов, особенно в сочетании с макрофагой маркировки трансгенных репортер линий. Использование живой потенциал изображения и экспериментальной уступчивости личинки зебры привело к много значительных понимание функции макрофага, которые имеют прямое отношение к болезни человека9,10,11,12,13,14,15. Многие из этих исследований также воспользовались высоким сохранением активности наркотиков у зебры (атрибут, который лежит в основе их использования в целом животных наркотиков открытие платформы16,17,18), используя химические вмешательства для фармакологически манипулировать макрофагов функции. На сегодняшний день эти фармакологические процедуры в основном доставляются либо через погружение, которое требует, чтобы препарат был водорастворимым, либо путем прямой микроинъекции свободного препарата(рисунок 1А). Ограничения этих стратегий пассивной доставки включают всебяи эффекты вне цели и общую токсичность, которые могут исключать оценку любого воздействия на функцию макрофагов. Кроме того, при исследовании воздействия препарата на макрофаги неизвестно, действуют ли препараты на сами макрофаги или через более косвенные механизмы. При выполнении аналогичных исследований химического вмешательства для изучения функции макрофагов, мы признали, что существует неудовлетворенная необходимость разработки недорогого и простого метода доставки для целевых препаратов специально для макрофагов.
Липосомы микроскопические, биосовместимые, липидные двухслойные пузырьки, которые могут инкапсулировать белки, нуклеотиды и лекарственныегрузы 19. Unilamellar или multilamellar липидный двухслойная структура липосом образует водный просвет, где водорастворимые препараты могут быть включены в то время как гидрофобные препараты могут быть интегрированы в липидные мембраны. Кроме того, физико-химические свойства липосом, включая размер, заряд и изменения поверхности, можно манипулировать, чтобы адаптировать их таргетинг к конкретным клеткам20,21. Эти особенности липосомы сделали их привлекательным средством для доставки лекарств и повышения точности текущих схем лечения20. Как липосомы, естественно, phagocytozed макрофагов (функция, используемая их регулярного использования в доставке клодроната специально для макрофагов для абляции экспериментов22), они представляют в качестве привлекательного варианта для макрофага конкретных доставки наркотиков (Рисунок 1B).
Этот протокол описывает формулировку препаратов в синие флуоресцентные липосомы, покрытые гидрофильных полимерных полоксамер 188, который образует защитный слой на поверхности липосомы и было показано, для повышения удержания наркотиков и имеют превосходную биосовместимость23. Poloxamer был выбран для покрытия поверхностного покрытия липосом, как наши предыдущие исследования показали, что, по сравнению с полиэтиленгликоль модифицированных липосом, полоксамер модифицированных липосом показал лучшую биосометность после подкожной инъекции крысиных лап и аналогичных фармакокинетических у кроликов после внутривенного вливания23. Протоколы также описаны для их микроинъекции в личиночных зебры и живой визуализации для оценки их макрофафаг-таргетирования способности и локализации внутриклеточных отсеков, необходимых для липосомного деградации и цитоплазматной доставки наркотиков. В качестве доказательства концепции мы ранее использовали этот метод для целевой два препарата макрофагов для подавления их активации в личинок зебры модель острого подагры воспаление24. Этот метод доставки наркотиков расширяет химический “инструментарий”, доступный для исследователей зебры, желающих обеспечить макрофаг-таргетинга своих препаратов, представляющих интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставили подробный протокол для формулирования нагруженных наркотиками липосом специально для макрофагов в личинок зебры. Этот метод может быть использован для вскрытия роли макрофагов в некоторых моделях заболеваний путем обеспечения прямой целенаправленной доставки…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами, присужденными C.J.H. (Совет по исследованиям в области здравоохранения Новой Зеландии и Фондмарса, Королевское общество Новой Зеландии) и З.В. (Фонд развития исследований факультета Оклендского университета). Авторы благодарят Алхада Махагаонкара за экспертное управление объектом зебры, Отделом исследований биомедицинских изображений, Школой Медицинских Наук, Оклендским университетом за помощь в разработке конфокальной визуализации и Грэмом Лишешке за то, что он подарил линию репортеров Tg (mpeg1:EGFP).
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
Referências
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers–liposomes and microspheres–on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Pesquisa do Câncer. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
