여기서 설명된 것은 생물학적으로 상승적인 miRNAs및 그들의 조립체를 짧은 트랜스게네인으로 특성화하기 위한 프로토콜이며, 이는 유전자 치료 애플리케이션을 위한 동시 과발현을 허용한다.
건강과 질병에 있는 microRNAs (miRNAs)의 생물학적 관련성은 단 하나 miRNA의 작용 보다는 오히려 많은 동시에 통제된 miRNAs의 특정 조합에 현저하게 의존합니다. 이러한 특정 miRNAs 모듈의 특성화는 치료에서의 사용을 극대화하는 근본적인 단계입니다. 이는 조합 특성이 실질적으로 악용될 수 있기 때문에 매우 관련이 있습니다. 여기서 기재된 것은 교모세포종에서 의질성 염색질 압압기의 조절과 관련된 특정 miRNA 시그니처를 정의하는 방법이다. 접근은 첫째로 정상 조직에 비교된 종양에서 통제되는 miRNAs의 일반적인 단을 정의합니다. 분석은 특정 세포 상태 도중 동시 표현되는 miRNAs의 하위 단을 강조하는 차등 배양 조건에 의해 더 구체화됩니다. 마지막으로, 이 필터를 만족시키는 miRNAs는 자연적으로 존재하는 miRNA 군집 유전자의 발판에 근거를 둔 인공 polycistronic transgenes로 결합되고, 수신 세포로 이 miRNA 모듈의 과발현을 위해 이용됩니다.
miRNAs는 암4,5를포함하여 많은 질병에 대한 광범위한 유전자 치료 접근법의 개발을위한 타의 추종을 불허하는 기회를 제공합니다1,2,3. 이는 이들의 작은 크기6,간단한 생물발생7,및 협회에서 기능하는 자연적인 경향을 포함하여 이들 생물학적 분자의 몇 가지 독특한 특징을 기반으로한다 8. 많은 질병은 종종 복잡한 생물학적 기능의 조절에 수렴하는 특정 miRNA 발현 패턴을 특징으로한다9. 이 방법의 목적은 먼저 특정 세포 기능에 대해 시너지 효과를 내는 miRNAs 그룹을 식별하는 전략을 정의하는 것입니다. 따라서, 다운스트림 연구 및 응용 분야에서 이러한 miRNA 조합의 재확립을 위한 전략을 제공한다.
이 방법은 여러 miRNAs의 기능 적 분석을 한 번에 허용하여 많은 수의 mRNA를 동시에 타겟팅하여 질병의 복잡한 풍경을 재구성합니다. 이 접근법은 최근에 1) 뇌암에서 동시에 하향 조절되는 3개의 miRNAs 의 그룹을 정의하기 위하여 채택되고 2) 방사선 또는 에 의한 유전자 독성 스트레스에 반응할 뿐만 아니라 신경 분화 도중 강한 동시 발현 패턴을 나타낸다 DNA 알킬화제. 아래에 기술된 클러스터링 방법에 의한 3개의 miRNAs의 조합 재발현은 암세포의 생물학과 심오한 간섭을 초래하며 전임상 연구를 위한 유전자 치료 전략으로서 용이하게 사용될 수 있다10. 이 프로토콜은 miRNA 연구 및 그 번역 응용에 관여하는 사람들에게 특히 관심이 있을 수 있습니다.
이 프로토콜은 단독으로 기능하는 것이 아니라 miRNA가 그룹에서 작업함으로써 생물학적으로 관련이 있다는 개념에 기초하며, 이들 그룹은 특정 세포 문맥26에의해 전사적으로 결정된다. 번역 관점에서이 접근을 정당화하기 위해 세포 / 조직에서이 다중 miRNA 패턴을 재현 할 수있는 후속 프로토콜이 도입됩니다. 이는 miRNA의 비교적 단순한 생체 발생을 이용하여 가능하며, 이에 의?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 지원과 건설적인 비판에 대한 하비 쿠싱 신경 종양학 연구소의 구성원에게 감사하고 자합니다. 이 작품은 NINDS 보조금 K12NS80223 및 P. P에 K08NS101091에 의해 지원되었다.
0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
1.5-mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |