Visualisering af Astrocyt morfologi ved hjælp af Lucifer Yellow iontophoresis
Summary
Astrocytter er morfologisk komplekse celler, eksemplificeret ved deres mange processer og Bushy territorier. For at analysere deres udførlige morfologi præsenterer vi en pålidelig protokol til at udføre intracellulær Lucifer gul iontophorese i let fast væv.
Abstract
Astrocytter er essentielle komponenter i neurale kredsløb. De flise hele centralnervesystemet (CNS) og er involveret i en række forskellige funktioner, som omfatter neurotransmitter clearance, ionregulering, synaptisk modulation, metaboliske støtte til neuroner, og blodgennemstrømning regulering. Astrocytter er komplekse celler, der har en Soma, flere store filialer, og talrige fine processer, der kontakter forskellige cellulære elementer i neuropil. For at vurdere morfologien af astrocytter, er det nødvendigt at have en pålidelig og reproducerbar metode til at visualisere deres struktur. Vi rapporterer en pålidelig protokol til at udføre intracellulær iontophorese af astrocytter ved hjælp af fluorescerende Lucifer gul (LY) farvestof i let fast hjernevæv fra voksne mus. Denne metode har flere funktioner, der er nyttige til at karakterisere astrocyt morfologi. Det giver mulighed for tredimensionel rekonstruktion af individuelle astrocytter, hvilket er nyttigt at udføre morfologiske analyser på forskellige aspekter af deres struktur. Immun histokemi sammen med ly iontoforese kan også udnyttes til at forstå samspillet mellem astrocytter med forskellige komponenter i nervesystemet og til at evaluere ekspression af proteiner inden for de mærkede astrocytter. Denne protokol kan implementeres i en række musemodeller af CNS lidelser til nøje at undersøge astrocyt morfologi med lys mikroskopi. LY iontoforese giver en eksperimentel tilgang til at evaluere astrocyt struktur, især i forbindelse med skade eller sygdom, hvor disse celler er foreslået at gennemgå betydelige morfologiske ændringer.
Introduction
Astrocytter er de mest rigelige gliale celler i centralnervesystemet (CNS). De spiller roller i ion homøostase, blodgennemstrømning regulering, synapse dannelse samt elimination, og neurotransmitter optagelse1. Den brede vifte af astrocyt funktioner afspejles i deres komplekse morfologiske struktur2,3. Astrocytter indeholder flere primære og sekundære grene, som opdeles i tusindvis af finere branchlets og foldere, der direkte interagerer med synapser, dendritter, axoner, blodkar og andre gliale celler. Astrocyte morfologi varierer på tværs af forskellige hjerneområder, som kan antyde deres evne til at udføre deres funktioner differentielt i neuronal kredsløb4. Desuden, astrocytter er kendt for at ændre deres morfologi under udvikling, under fysiologiske forhold, og i flere sygdomstilstande3,5,6.
En konsistent, reproducerbar metode er nødvendig for præcist at løse kompleksiteten af astrocyt morfologi. Traditionelt har immun histokemi været brugt til at visualisere astrocytter med brug af astrocyt specifikke eller astrocyt beriget protein markører. Men disse metoder afslører mønsteret af protein udtryk i stedet for strukturen af astrocyt. De almindeligt anvendte markører, såsom gliaceller fibrillært syreholdigt protein (GFAP) og S100 calcium bindende protein β (S100β), udtrykker ikke i hele cellens volumen og løser derfor ikke fuldstændig morfologi7. Genetiske tilgange til at udtrykke fluorescerende proteiner allestedsnærværende i astrocytter (virale injektioner eller transgene muse reporter linjer) kan identificere de finere grene og samlede territorium. Men det er svært at skelne individuelle astrocytter, og analyser kan være partisk af astrocyt populationen målrettet af den specifikke promotor8. Seriel sektion elektronmikroskopi er blevet brugt til at afsløre et detaljeret billede af samspillet mellem astrocyt processer med synapser. På grund af de tusindvis af astrocyt processer, der kontakter synapser, er det i øjeblikket ikke muligt at rekonstruere en hel celle med denne teknik9, selv om dette forventes at ændre sig med brugen af Machine Learning tilgange til dataanalyse.
I denne rapport fokuserer vi på en procedure til at karakterisere mus astrocytter ved hjælp af intracellulær iontophorese med Lucifer Yellow (LY) farvestof, ved hjælp af Carnot stratum radiatum som et eksempel. Metoden er baseret på banebrydende tidligere arbejde af Eric Bushong og Mark Ellisman10,11. Astrocytter fra let fast hjerne skiver er identificeret ved deres karakteristiske Soma form og fyldt med LY. Cellerne er derefter afbildet med confokal mikroskopi. Vi demonstrerer, hvordan LY iontophorese kan bruges til at rekonstruere individuelle astrocytter og udføre detaljerede morfologiske analyser af deres processer og territorium. Denne metode kan også anvendes sammen med immun histokemi til at identificere rumlige relationer og interaktioner mellem astrocytter og neuroner, andre gliale celler og hjernens vaskulatur. Vi betragter ly iontoforese at være et meget velegnet værktøj til at analysere morfologi i forskellige hjerneområder og musemodeller af sunde eller sygdomstilstande7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metode, der er skitseret i dette papir beskriver en måde at visualisere astrocyt morfologi ved hjælp af intracellulær iontophorese af LY farvestof i let fast hjernen skiver. Der er flere kritiske faktorer fremhævet i denne protokol, der bidrager til vellykket ly iontoforese og morfologiske rekonstruktion af cellerne. En faktor er kvaliteten og reproducerbarhed af billederne, som er bestemt i høj grad af alder af musen og resultatet af perfusion. I denne undersøgelse brugte vi C57/BL6N mus 6 − 8 uger gamle. En…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker fru Soto, Dr. Yu, og Dr. Octeau for vejledning samt kommentarer til teksten. Dette arbejde understøttes af NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
Referências
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neurociência. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
