Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese
Summary
Astrozyten sind morphologisch komplexe Zellen, die durch ihre vielfältigen Prozesse und buschigen Territorien veranschaulicht werden. Um ihre aufwendige Morphologie zu analysieren, präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll, um intrazelluläre Luzifer gelbe Iontophorese in leicht fixiertem Gewebe durchzuführen.
Abstract
Astrozyten sind wesentliche Bestandteile neuronaler Schaltkreise. Sie kacheln das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS) und sind an einer Vielzahl von Funktionen beteiligt, die Neurotransmitter Clearance, Ionenregulierung, synaptische Modulation, metabolische Unterstützung für Neuronen, und Blutflussregulierung gehören. Astrozyten sind komplexe Zellen, die ein Soma, mehrere Hauptzweige und zahlreiche feine Prozesse haben, die verschiedene zelluläre Elemente innerhalb des Neuropils kontaktieren. Um die Morphologie von Astrozyten zu beurteilen, ist es notwendig, eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zu haben, um ihre Struktur zu visualisieren. Wir berichten über ein zuverlässiges Protokoll zur intrazellulären Iontophorese von Astrozyten mit fluoreszierendem Luzifergelb (LY) Farbstoff in leicht fixiertem Hirngewebe von erwachsenen Mäusen. Diese Methode hat mehrere Funktionen, die nützlich sind, um Astrozytenmorphologie zu charakterisieren. Es ermöglicht eine dreidimensionale Rekonstruktion einzelner Astrozyten, die nützlich ist, um morphologische Analysen zu verschiedenen Aspekten ihrer Struktur durchzuführen. Die Immunhistochemie kann zusammen mit der LY-Iontophorese auch genutzt werden, um die Wechselwirkung von Astrozyten mit verschiedenen Komponenten des Nervensystems zu verstehen und die Expression von Proteinen innerhalb der markierten Astrozyten zu bewerten. Dieses Protokoll kann in einer Vielzahl von Mausmodellen von ZNS-Störungen implementiert werden, um die Astrozytenmorphologie mit Lichtmikroskopie streng zu untersuchen. Die LY-Iontophorese bietet einen experimentellen Ansatz zur Bewertung der Astrozytenstruktur, insbesondere im Zusammenhang mit Verletzungen oder Krankheiten, bei denen diese Zellen signifikante morphologische Veränderungen erfahren sollen.
Introduction
Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im Zentralnervensystem (ZNS). Sie spielen Rollen in Ionenhomöostase, Blutflussregulation, Synapse-Bildung sowie Elimination, und Neurotransmitter Aufnahme1. Das breite Spektrum der Astrozytenfunktionen spiegelt sich in ihrer komplexen morphologischen Struktur2,3wider. Astrozyten enthalten mehrere primäre und sekundäre Zweige, die sich in Tausende von feineren Zweigen und Flugblättern teilen, die direkt mit Synapsen, Dendriten, Axonen, Blutgefäßen und anderen Gliazellen interagieren. Astrozytenmorphologie variiert zwischen verschiedenen Hirnregionen, was auf ihre Fähigkeit hindeuten kann, ihre Funktionen differenziell in neuronalen Schaltkreisen auszuführen4. Darüber hinaus sind Astrozyten dafür bekannt, ihre Morphologie während der Entwicklung, während physiologischer Bedingungen und in mehreren Krankheitszuständen3,5,6zu verändern.
Eine konsistente, reproduzierbare Methode ist erforderlich, um die Komplexität der Astrozytenmorphologie genau aufzulösen. Traditionell wurde die Immunhistochemie verwendet, um Astrozyten mit der Verwendung von astrozytenspezifischen oder astrozytenangereicherten Proteinmarkern zu visualisieren. Diese Methoden zeigen jedoch eher das Muster der Proteinexpression als die Struktur der Astrozyten. Die häufig verwendeten Marker, wie z.B. glialfibrilläres saures Protein (GFAP) und S100 Calciumbindungsprotein (S100), drücken nicht im gesamten Zellvolumen aus und lösen somit keine vollständige Morphologie7. Genetische Ansätze zur Expressfluoreszenzproteine in Astrozyten (virale Injektionen oder transgene Mausreporterlinien) können die feineren Zweige und das gesamte Territorium identifizieren. Es ist jedoch schwierig, einzelne Astrozyten zu unterscheiden, und Analysen können durch die Astrozytenpopulation verzerrt werden, die vom spezifischen Promotor angestrebt wird8. Serial section electron microscopy wurde verwendet, um ein detailliertes Bild der Wechselwirkungen von Astrozytenprozessen mit Synapsen zu enthüllen. Aufgrund der Tausenden von Astrozytenprozessen, die synapses kontaktieren, ist es derzeit nicht möglich, eine ganze Zelle mit dieser Technik9zu rekonstruieren, obwohl dies sich mit dem Einsatz von Machine Learning-Ansätzen für die Datenanalyse ändern dürfte.
In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Mausastrozyten mit intrazellulärer Iontophorese mit Luzifergelb (LY) Farbstoff, am Beispiel des CA1-Stratum-Radiatums. Die Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten von Eric Bushong und Mark Ellisman10,11. Astrozyten aus leicht fixierten Hirnscheiben werden durch ihre unverwechselbare Soma-Form identifiziert und mit LY gefüllt. Die Zellen werden dann mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Wir zeigen, wie LY-Iontophorese verwendet werden kann, um einzelne Astrozyten zu rekonstruieren und detaillierte morphologische Analysen ihrer Prozesse und gebiete durchzuführen. Auch kann diese Methode in Verbindung mit der Immunhistochemie angewendet werden, um räumliche Beziehungen und Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und Neuronen, anderen Gliazellen und Gehirnvaskulatur zu identifizieren. Wir betrachten LY Iontophorese als ein sehr geeignetes Werkzeug, um Morphologie in verschiedenen Hirnregionen und Mausmodelle von gesunden oder Krankheitszuständen7,12,13zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Artikel beschriebene Methode beschreibt eine Möglichkeit, die Astrozytenmorphologie mit intrazellulärer Iontophorese von LY-Farbstoff in leicht fixierten Gehirnscheiben zu visualisieren. Es gibt mehrere kritische Faktoren, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden, die zu einer erfolgreichen LY-Iontophorese und morphologischen Rekonstruktion der Zellen beitragen. Ein Faktor ist die Qualität und Reproduzierbarkeit der Bilder, die weitgehend durch das Alter der Maus und das Ergebnis der Perfusion bestim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Frau Soto, Dr. Yu und Dr. Octeau für die Anleitung sowie Kommentare zum Text. Diese Arbeit wird von NS060677 unterstützt.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
Referências
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