Analyse af hæmatopoietisk Stam Progenitorcellernes metabolisme
Summary
Hæmatopoietiske Stam progenitorceller (Hspc’er) overgang fra en lysende tilstand til en differentierings tilstand på grund af deres metaboliske plasticitet under dannelse af blod. Her præsenterer vi en optimeret metode til måling af mitokondrie respiration og glycolyse af Hspc’er.
Abstract
Hæmatopoietiske Stam progenitorceller (Hspc’er) har en distinkt metabolisk plasticitet, som giver dem mulighed for at overgå fra deres lysende tilstand til en differentierings tilstand for at opretholde kravene til bloddannelsen. Men, det har været vanskeligt at analysere metabolisk status (mitokondrie respiration og glycolyse) af Hspc’er på grund af deres begrænsede antal og mangel på optimerede protokoller for ikke-vedlige, skrøbelige Hspc’er. Her giver vi et sæt klare, trin-for-trin instruktioner til at måle metabolisk respiration (iltforbrug sats; OCR) og glykolyse (ekstracellulær forsurings hastighed; VOGN) af murine knoglemarvs LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspc’er. Denne protokol giver en højere mængde af LSK Hspc’er fra murine knoglemarv, forbedrer levedygtigheden af Hspc’er under inkubation, letter ekstracellulære flux analyser af ikke-klæbende Hspc’er, og giver optimerede injektions protokoller (koncentration og tid) for lægemidler rettet mod oxidativ fosforylering og glykolytiske veje. Denne metode gør det muligt at forudsige den metaboliske status og sundheden for Hspc’er under blod udvikling og sygdomme.
Introduction
Da levetiden for de fleste modne blodlegemer er kort, er homøostase af blod afhængig af selvfornyelse og differentiering af en langvarig, men sjælden population af hæmatopoietiske stamceller (Hspc’er)1. Hspc’er er quiescent, men de er hurtige til at formere sig og undergår differentiering efter stimulation for at opretholde kravene i blodsystemet. Da hver HSPC cellulære tilstand kræver en unik bioenergetisk efterspørgsel, de metaboliske ændringer er centrale drivkræfter for HSPC skæbne beslutninger. Derfor, tabet af metabolisk plasticitet, ved at ændre balancen mellem quiescence, selvfornyelse, og differentiering af Hspc’er, ofte fører til myelo-eller lympho-proliferative lidelser. Sammen, forståelsen af metaboliske regulering af HSPC udvikling er afgørende for at afdække mekanismer underliggende hæmatologiske maligniteter2,3,4,5.
Mitokondrie respiration og glycolyse genererer ATP til at drive intracellulære reaktioner og producere de byggeklodser, som er nødvendige for makromolekyle syntese. Da hspc’er har lav mitokondrie masse sammenlignet med differentierede celler6 og de opretholder inaktive i hypoxisk knoglemarvs nicher, er hspc’er primært afhængige af glykolyse. Aktivering af hspc’er forbedrer deres mitokondrie metabolisme, der fører til tab af inaktive og deres efterfølgende indtræden i cellecyklussen. En sådan metabolisk plasticitet af hspc’er gør det muligt at vedligeholde HSPC-puljen i hele voksenlivet6,7,8,9,10,11,12. Derfor er det afgørende at undersøge deres metaboliske aktiviteter, såsom iltforbrug (OCR, indeks for oxidativ fosforylering) og den ekstracellulære forsuring (ECAR, Index of glycolyse) for at analysere HSPC-aktiveringen og sundhedsstatussen. Både OCR og ECAR kan måles samtidigt, i realtid, ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator. Men den aktuelle metode kræver et stort antal celler og er optimeret til vedlige celler13. Da Hspc’er ikke kan isoleres i store mængder fra mus14, kræver sortering for at opnå en ren population, er ikke-vedstående celler15, og kan ikke dyrkes natten over uden at undgå differentiering16, har det været vanskeligt at måle OCR og ECAR af hspc’er. Her giver vi et sæt af klare, trin-for-trin instruktioner til at ledsage video-baserede tutorials om, hvordan man måler metabolisk respiration og glycolyse af få tusinder murine knoglemarv-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspc’er.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi isolering af en maksimal mængde af ren og levedygtig murine LSK HSPCs befolkning samt måling af deres glycolyse og mitokondrie respiration med en ekstracellulær flux analysator. Protokollen overvinder især følgende tekniske problemer i forbindelse med brugen af LSK Hspc’er: i) den lave hyppighed af LSK Hspc’er i murine knoglemarv14, II) lav basal metabolisk aktivitet af LSK hspcs26, III) skrøbelighed af LSK hspcs27, og IV) manglend…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er delvis støttet af finansieringen støtte fra National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick Foundation, og Pelotonia Foundation.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
Referências
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family–role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine–molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
