JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

El-Tozlaşma, Mikroskopi ve Genetik Analizleri Birleştiren Kayısıda Öz ve İnter-(in)Uyumluluk İlişkilerinin Belirlenmesi

Published: June 16, 2020
doi:
10.3791/60241
, , ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Summary

Flüoresan mikroskopi ile öz-genotiyon un belirlenmesini birleştiren kayısı(Prunus armeniaca L.) çeşitlerinin tozlaşma gereksinimlerini niçin pcr analizi ile s-genotipinin tanımlanması ile biraraya getiren bir metodoloji salıyoruz.

Abstract

Rosaceae’de kendi kendine uyumsuzluk, esas olarak multiallelik lokus S tarafından kontrol edilen Gametofitik Kendi Kendine Uyumsuzluk Sistemi (GSI) tarafından belirlenir. Kayısıda, önemli sayıda yeni çeşidinin serbest bırakılması bilinmeyen tozlaşma gereksinimlerine sahip çeşitlerin artmasına yol açtığı ndan, öz ve inter-(in) uyumluluk ilişkilerinin belirlenmesi giderek daha önemlidir. Burada, el-polenler ve mikroskopi ile öz-(in)uyumluluğunun belirlenmesini PCR analizi ile S-genotipinin tanımlanması ile birleştiren bir metodolojiyi açıklıyoruz. Uyumluluk tespiti için, her bir çeşitten balon aşamasında çiçekler toplanmış, laboratuvarda elle tozlaşmış, sabit lenmiş ve floresan mikroskopisi altında polen tüpü davranışlarının gözlemi için anilin mavisi ile boyanmıştır. Çeşitleri arasında uyumsuzluk ilişkilerinin kurulması için, her çeşitdna genç yapraklarından elde edildi ve S-alel PCR tarafından tespit edildi. Bu yaklaşım, yeni meyve bahçeleri tasarımında uygun tozlaştırıcıları seçmek ve Üreme programlarında uygun ebeveynleri seçmek için değerli bilgiler sağlayan çeşitler arasındaki uyumsuzluk ilişkilerini açıklığa kavuşturmaya ve uyumsuzluk ilişkileri ortaya çıkarmasına olanak sağlar.

Introduction

Kendi kendine uyumsuzluk kendi kendine tozlaşma önlemek ve1outcrossing teşvik çiçekli bitkilerin bir stratejidir. Rosaceae’de bu mekanizma, esas olarak multiallelic locus S2tarafından kontrol edilen Gametofitik Kendi Kendine Uyumsuzluk Sistemi (GSI) tarafından belirlenir. Tarzında, RNase geni S-stylar determinant kodlar, bir RNase3, Bir F-box protein, S-polenbelirleyici belirler, SFB gen4tarafından kodlanmış iken . Kendi kendine uyumsuzluk etkileşimi ovule döllenme engelleyen tarzı boyunca polen tüpü büyüme inhibisyonu yoluyla gerçekleşir5,6.

Kayısı, bir varietal yenileme son yirmi yılda dünya çapında yer almıştır7,8. Yeni çeşitlerin önemli bir sayı bu giriş, farklı kamu ve özel üreme programlarından, bilinmeyen tozlaşma gereksinimleri ile kayısı çeşitlerinin artmasına neden olmuştur8.

Kayısıda tozlaşma gereksinimlerini belirlemek için farklı metodolojiler kullanılmıştır. Alanında, kendini-(in)uyumluluk kafesli ağaçlarda veya hadım edilmiş çiçeklerde kontrollü pollinations tarafından kurulmuş ve daha sonra meyve seti yüzdesi kayıt9,10,11,12. Buna ek olarak, kontrollü pollinations çiçek yarı-in vivo kültür ve floresan mikroskopi8altında polen tüp davranış analizi tarafından laboratuvarda yapılmıştır 8,13,14,15,16,17. Son zamanlarda, pcr analizi ve dizileme gibi moleküler teknikler, RNase ve SFB genlerinin çalışmasına dayalı uyumsuzluk ilişkilerinkarakterizasyonu izin var18,19. Kayısıda, otuz üç S-alel bildirilmiştir (S1 – S20, S22 – S30, S52, S53, Sv, Sx), kendi kendine uyumluluk ile ilgili bir alel dahil (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Şimdiye kadar, 26 uyumsuzluk grupları S-genotip8,9,17,,25,26,27göre bu tür bıçaklanmış edilmiştir. Aynı Salellerine sahip çeşitleri birbirine uyumsuz, en az bir farklı S-alel ile ve dolayısıyla farklı uyumsuz gruplara ayrılan çeşitleri birbirine uyumludur.

Kayısı çeşitlerinin tozlaşma gereksinimlerini tanımlamak için, flüoresan mikroskobu ile öz-(in)uyumluluk tayinini, kayısı çeşitlerinde PCR analizi ile S-genotipinin tanımlanması ile birleştiren bir metodoloji yi tanımlıyoruz. Bu yaklaşım uyumsuzluk gruplarının oluşturulmasına ve tarikatlar arasındaki uyumsuzluk ilişkilerinin açıklığa kavuşturulmasına olanak sağlar.

Protocol

1. Kendi kendine uyumluluk tayini Alandaki çiçekleri tadına var. İstenmeyen önceki tozlaşmayıFigure 1Aönlemek için, kayısı28için BBCH ölçeğinde 58. Laboratuvarda kendi kendine ve çapraz tozlaşmalara Balon aşamasında çiçek anthers çıkarın ve laboratuvar sıcaklığında kuruması için bir kağıt parçası üzerine yerleştirin. 24 saat sonra polen tanelerini ince bir ?…

Representative Results

Kayısıda tozlaşma çalışmaları, antezten bir gün önce geç balon evresinde çiçek kullanılmasını gerektirir (Şekil 1A). Çiçek yapıları neredeyse olgun olduğundan bu aşama hem polen hem de pistil koleksiyon için en uygun evre olarak kabul edilir, ancak anher ayrılması henüz gerçekleşmemiştir. Kapalı yaprakları dış polen taşıyan böceklerin gelişini engellediği için, bu sadece aynı çiçekten değil, diğer çiçeklerden de istenmeyen polenl…

Discussion

Geleneksel olarak, en ticari kayısı Avrupa çeşitleri kendi kendine uyumlu36edildi. Bununla birlikte, son yıllarda üreme programlarında ebeveyn olarak Kuzey Amerika kendini uyumsuz çeşitlerin kullanımı bilinmeyen tozlaşma gereksinimleri7ile yeni kendini uyumsuz çeşitlerin artan sayıda serbest bırakılması ile sonuçlandı7 ,8,37. Bu nedenle kayısı çeşitlerinde öz ve inter-(in) uyumlul…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-European Development Fund, Avrupa Birliği (AGL2016-77267-R ve AGL2015-74071-JIN) tarafından finanse edilmiştir; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-Avrupa Sosyal Fonu, Avrupa Birliği (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad ve Agroseguro S.A.

Materials

Agarose D1 Low EEO Conda 8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit Bioline BIO-21060
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
CEQ System Software Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol Bioline BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 Beckman Coulter 608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer Beckman Coulter 608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1 Beckman Coulter 391438
HyperLadder 100bp Bioline BIO-33029
HyperLadder 1kb Bioline BIO-33025
Image Analysis System Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system  Bio-Rad 170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 13-400-518
pH-Meter BASIC 20 Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit Thermo Fisher Scientific F553S
Power Pack P 25 T Biometra
Primer Forward Isogen Life Science
Primer Reverse Isogen Life Science
Quantity One Software Bio-Rad
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Sub-Cell GT Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Taq DNA Polymerase QIAGEN 201203
Vertical Stand Autoclave JP Selecta
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Silva, N. F., Goring, D. R. Mechanisms of self-incompatibility in flowering plants. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, 1988-2007 (2001).
  2. Charlesworth, D., Vekemans, X., Castric, V., Glémin, S. Plant self-incompatibility systems: A molecular evolutionary perspective. New phytologist. 168, 61-69 (2005).
  3. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38, 304-311 (1997).
  4. Ushijima, K., et al. Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond: Identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism. The Plant cell. 15, 771-781 (2003).
  5. Bedinger, P. A., Broz, A. K., Tovar-Mendez, A., McClure, B. Pollen-Pistil Interactions and Their Role in Mate Selection. Plant Physiology. 173, 79-90 (2017).
  6. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: A review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  7. Zhebentyayeva, T., Ledbetter, C., Burgos, L., Llacer, G., Badenes, M. L., Byrne, D. Apricot. Fruit Breeding. , 415-458 (2012).
  8. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing Production in the New Generation of Apricot Cultivars: Self-incompatibility, S-RNase Allele Identification, and Incompatibility Group Assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
  9. Egea, J., Burgos, L. Detecting Cross-incompatibility of Three North American Apricot Cultivars and Establishing the First Incompatibility Group in Apricot. Journal of the American Society for Horticultural Science. 121, 1002-1005 (1996).
  10. Rodrigo, J., Herrero, M. Effects of pre-blossom temperatures on flower development and fruit set in apricot. Scientia Horticulturae. 92, 125-135 (2002).
  11. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower bud differentiation and development in fruiting and non-fruiting shoots in relation to fruit set in apricot (Prunus armeniaca). Trees. 24, 833-841 (2010).
  12. Muñoz-Sanz, J. V., Zuriaga, E., López, I., Badenes, M. L., Romero, C. Self-(in)compatibility in apricot germplasm is controlled by two major loci, S and M. BMC Plant Biology. 17, 82 (2017).
  13. Burgos, L., Berenguer, T., Egea, J. Self- and Cross-compatibility among Apricot Cultivars. HortScience. 28, 148-150 (1993).
  14. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot “Moniqui”. Journal of Horticultural Science. 71, 801-805 (1996).
  15. Milatović, D., Nikolić, D., Krška, B. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars from European breeding programmes. Horticultural Science. 40 (2), 65-71 (2013).
  16. Milatović, D., Nikolić, D., Fotirić-Aksić, M., Radović, A. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus. 12 (6), 103-113 (2013).
  17. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of Self-Incompatibility Alleles by Specific PCR Analysis and S-RNase Sequencing in Apricot. Int J Mol Sci. 19, 3612 (2018).
  18. Romero, C., et al. Analysis of the S-locus structure in Prunus armeniaca L. Identification of S-haplotype specific S-RNase and F-box genes. Plant Molecular Biology. 56, 145-157 (2004).
  19. Halász, J., Pedryc, A., Hegedus, A. Origin and dissemination of the pollen-part mutated SC haplotype which confers self-compatibility in apricot (Prunus armeniaca). New Phytologist. 176, 792-803 (2007).
  20. Halász, J., Hegedus, A., Hermán, R., Stefanovits-Bányai, &. #. 2. 0. 1. ;., Pedryc, A. New self-incompatibility alleles in apricot (Prunus armeniaca L.) revealed by stylar ribonuclease assay and S-PCR analysis. Euphytica. 145, 57-66 (2005).
  21. Vilanova, S., Romero, C., Llacer, G., Badenes, M. L., Burgos, L. Identification of Self-(in)compatibility Alleles in Apricot by PCR and Sequence Analysis. Journal of the American Society for Horticultural Science. 130, 893-898 (2005).
  22. Feng, J., et al. Detection and transcript expression of S-RNase gene associated with self-incompatibility in apricot (Prunus armeniaca L.). Molecular Biology Reports. 33, 215-221 (2006).
  23. Zhang, L., et al. Identification of self-incompatibility (S-) genotypes of Chinese apricot cultivars. Euphytica. 160, 241-248 (2008).
  24. Wu, J., et al. Identification of S-haplotype-specific S-RNase and SFB alleles in native Chinese apricot (Prunus armeniaca L). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 84, 645-652 (2009).
  25. Szabó, Z., Nyéki, J. Blossoming, fructification and combination of apricot varieties. Acta Horticulturae. 293, 295-302 (1991).
  26. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K. U., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135, 410-417 (2010).
  27. Lachkar, A., et al. Identification of self-(in)compatibility S-alleles and new cross-incompatibility groups in Tunisian apricot (Prunus armeniaca L.) cultivars. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 88, 497-501 (2013).
  28. Pérez-Pastor, A., Ruiz-Sánchez, M. C., Domingo, R., Torrecillas, A. Growth and phenological stages of Búlida apricot trees in South-East. Agronomie. 24, 93-100 (2004).
  29. Williams, J. H., Friedman, W. E., Arnold, M. L. Developmental selection within the angiosperm style: using gamete DNA to visualize interspecific pollen competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 9201-9206 (1999).
  30. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Anther meiosis time is related to winter cold temperatures in apricot (Prunus armeniaca L.). Environmental and Experimental Botany. 100, 20-25 (2014).
  31. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A., Rodrigo, J. Lack of Fruit Set Caused by Ovule Degeneration in Japanese Plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  32. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower Emasculation as the Cause for Lack of Fruit Set in Japanese Plum Crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  33. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  34. Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil Starch Reserves at Anthesis Correlate with Final Flower Fate in Avocado (Persea americana). PLOS ONE. 8 (10), 78467 (2013).
  35. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through Identification, Characterization and cDNA cloning for S-RNases in Sweet Cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124, 224-233 (1999).
  36. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science. 72, 147-154 (1997).
  37. Hormaza, J. I., Yamane, H., Rodrigo, J., Kole, C. Apricot. Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants, Volume 4 Fruits and Nuts. , 171-187 (2007).
  38. Benmoussa, H., Ghrab, M., Ben Mimoun, M., Luedeling, E. Chilling and heat requirements for local and foreign almond (Prunus dulcis Mill.) cultivars in a warm Mediterranean location based on 30 years of phenology records. Agricultural and Forest Meteorology. 239, 34-46 (2017).
  39. Rodrigo, J., Herrero, M., Hormaza, J. I. Pistil traits and flower fate in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Applied Biology. 154, 365-375 (2009).
  40. Williams, R. R., Williams, R. R., Wilson, D. Techniques used in fruit-set experiments. Towards Regulated Cropping. , 57-61 (1970).
  41. Sutherland, B. G., Robbins, T. P., Tobutt, K. R. Primers amplifying a range of Prunus S-alleles. Plant Breeding. 123, 582-584 (2004).
  42. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8, 4321-4325 (1980).
  43. Porebski, S., Bailey, L. G., Baum, B. R. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant Molecular Biology Reporter. 15 (1), 8-15 (1997).
  44. Rogers, S. O., Bendich, A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5 (2), 69-76 (1985).
  45. Hormaza, J. I. Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics. 104, 321-328 (2002).
  46. Sonneveld, T., Tobutt, K. R., Robbins, T. P. Allele-specific PCR detection of sweet cherry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using consensus and allele-specific primers. Theoretical and Applied Genetics. 107, 1059-1070 (2003).
  47. Hegedus, A., Lénárt, J., Halász, J. Sexual incompatibility in Rosaceae fruit tree species: molecular interactions and evolutionary dynamics. Biologia Plantarum. 56 (2), 201-209 (2012).
  48. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  49. Company, R. S. i., Kodad, O., Martí, A. F. i., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: From deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  50. Boskovic, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  51. Cachi, A. M., Wünsch, A. S-genotyping of sweet cherry varieties from Spain and S-locus diversity in Europe. Euphytica. 197 (2), 229-236 (2014).
  52. Zuriaga, E., et al. An S-locus Independent Pollen Factor Confers Self-Compatibility in “Katy” Apricot. PLoS ONE. 8 (1), 53947 (2013).

Tags

Self-compatibilityInter-compatibilityIncompatibilityApricotHand-pollinationMicroscopyGenetic AnalysisPollination RequirementsCultivar IdentificationIncompatibility GroupsSelf-incompatibilityFruit Tree CropsCherryPlumBBCH ScaleEmasculationPollen GerminationMicroscopyFixative SolutionEthanolPollen Germination MediumSodium SulfiteAutoclaving
check_url/pt/60241?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. J. Vis. Exp. (160), e60241, doi:10.3791/60241 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image