Bulk druppel verglazing voor primaire hepatocyten conservering
Summary
Dit manuscript beschrijft een ijsvrije cryopreservatie-methode voor grote hoeveelheden rat hepatocyten waarbij primaire cellen worden voorgeïnpoleerd met cryoprotective agenten in een lage concentratie en verglaasd in grote druppels.
Abstract
Vitrificatie is een veelbelovend ijsvrij alternatief voor klassiek langzaam invriezen (bij ongeveer 1 °C/min) cryopreservering van biologische monsters. Vitrificatie vereist extreem snelle koelsnelheden om de overgang van water in de glas fase te bereiken, terwijl schadelijke ijsvorming wordt vermeden. Hoewel pre-incubatie met cryoprotective agents (CPA) de kritische koelsnelheid van biologische monsters kan verminderen, zijn hoge concentraties in het algemeen nodig om ijsvrije cryopreservering door vitrificatie mogelijk te maken. Hierdoor wordt vitrificatie belemmerd door CPA-toxiciteit en beperkt tot kleine monsters die snel kunnen worden gekoeld. Onlangs werd aangetoond dat deze inherente beperkingen kunnen worden overwonnen door bulk druppeltjes verglazing. Met behulp van deze nieuwe methode worden cellen eerst vooraf geïnincubeerd met een lage intracellulaire CPA-concentratie. Door gebruik te maken van snelle osmotische uitdroging, is de intracellulaire CPA direct voor vitrificatie geconcentreerd, zonder de noodzaak om toxische CPA-concentraties volledig te equilibraten. De cellulaire uitdroging wordt uitgevoerd in een fluïdisch apparaat en geïntegreerd met continue hoge doorvoer generatie van groot formaat druppels die zijn verglaasd in vloeibare stikstof. Deze Ice-Free cryopreservatie-methode met minimale CPA-toxiciteit is geschikt voor grote celhoeveelheden en resulteert in een verhoogde levensvatbaarheid van hepatocyten en metabole functie in vergelijking met klassieke langzaam invriezing cryopreservatie. Dit manuscript beschrijft de methoden voor een succesvolle verglazing van de bulk druppel in detail.
Introduction
Verlies van de levensvatbaarheid van de cel en metabole functie na cryopreservatie van hepatocyten is nog steeds een belangrijk probleem dat de klinische toepassingen beperkt1,2,3. De benchmark methode van hepatocyte cryopreservatie is traag invriezen, die wordt uitgevoerd door het pre-incuberen van de hepatocyten met CPA (dimethylsulfoxide [DMSO], glucose en albumine) en daaropvolgende gecontroleerde snelheid bevriezing (bij ongeveer 1 °c/min) tot cryogene temperaturen4,5. Ondanks veel gerapporteerde optimalisaties blijven CPA-toxiciteit samen met schadeveroorzakende osmotische onevenwichtigheden tijdens het invriezen en mechanische stress van ijsvorming fundamentele nadelen van traag bevriezen van6,7.
Vitrificatie biedt een voordeel ten opzichte van langzaam invriezen in dat letsel als gevolg van ijsvorming wordt volledig vermeden door een directe faseovergang van water in de glas staat6. Om de Glasovergangstemperatuur van zuiver water (-137 °C) te bereiken, moet het water echter worden gekoeld tegen snelheden in de volgorde van 1.000.000 graden Celsius per seconde (d.w.z. de kritische koelsnelheid) om ijsvorming boven de glazen overgangstemperatuur te voorkomen8 . Toevoeging van Ocmw’s kan de kritische koelsnelheid verlagen en de Glasovergangstemperatuur van waterige oplossingen9verhogen. Echter, zelfs met hoge CPA-concentraties (bijv. 40% v/v DMSO of hoger) zijn de snelle koelsnelheden niettemin vereist voor een succesvolle verglavering van8,9.
De vereiste koelsnelheden en hoge CPA-concentraties resulteren in twee belangrijke nadelen van vitrificatie. Ten eerste, om snelle koeling mogelijk te maken, moeten de monsters een lage thermische massa hebben. Ten tweede, om hoge CPA-concentraties te bereiken terwijl osmotische schade wordt vermeden, moet de Ocmw’s langzaam worden ingevoerd en volledig worden geëscaleerd tussen de intra-en extracellulaire compartimenten6. Dit verhoogt de blootstellingstijd van cellen tot toxische Ocmw’s. Samen maakt dit de verglavering tot een omslachtig proces dat beperkt is tot enkele kleine samples (micro liters) tegelijkertijd. Droplet-vitrificatie is voorgesteld als een mogelijke oplossing voor deze beperkingen. Door minuscule cel-beladen druppeltjes (nanoliters) aan vloeibare stikstof bloot te stellen, wordt de koelsnelheid aanzienlijk verhoogd, waardoor een aanzienlijke reductie van de CPA-concentratie mogelijk is10,11,12 ,13,14. Hoewel meerdere hoogfrequente druppel genererende nozzles gelijktijdig kunnen worden gebruikt, beperkt de extreem kleine druppelgrootte de doorvoer tot micro liters per minuut10, wat een efficiënte verglazing van grote cellen uitsluit volumes met magnitudes hogere verwerkingssnelheden op de orde van milliliter per minuut.
Onlangs werd aangetoond dat deze inherente beperkingen van vitrificatie kunnen worden overwonnen door bulk druppeltjes vitrificatie15. Deze nieuwe methode maakt gebruik van snelle osmotische dehydratie om een intracellulaire CPA-concentratie van 7,5% v/v ethyleenglycol en DMSO onmiddellijk voorafgaand aan vitrificatie te concentreren, waardoor de noodzaak van volledige evenwichting van toxische CPA-concentraties wordt geëlimineerd. De cellulaire dehydratie wordt uitgevoerd in een fluïdisch apparaat door een korte blootstelling van de hepatocyten aan een hoge extracellulaire CPA-concentratie. Hoewel deze blootstelling snelle osmotische uitdroging veroorzaakt, is het te kort om de hoge CPA-concentratie te verspreiden in de cellen. Onmiddellijk na uitdroging worden de cellen geladen in druppels die rechtstreeks in vloeibare stikstof worden verglaasd. Deze methode elimineert de noodzaak van volledige intracellulaire opname van hoge CPA-concentraties, terwijl de hoge extracellulaire CPA-concentratie vitrificatie van groot formaat druppels mogelijk maakt, resulterend in hoge doorvoer volumes met minimale CPA-toxiciteit.
Druppel vitrificatie verbetert de levensvatbaarheid op de directe en lange termijn na conservering, evenals de morfologie en metabole functie van primaire rat hepatocyten in vergelijking met klassieke cryopreservatie door Slow-bevriezing15. Dit manuscript verschaft de methodologische Details voor bulk druppel verglazing van primaire rat hepatocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cryopreservation van hepatocyten door Slow-bevriezing resulteert in verminderde levensvatbaarheid en metabole functie. Vitrificatie biedt een veelbelovend alternatief voor klassieke cryopreservering, omdat het bevriezen van letsel volledig wordt vermeden9. Echter, pre-incubatie met Ocmw’s is nodig om de kritische koelsnelheid te verlagen8. Bijgevolg wordt de vitrificatie belemmerd door CPA-toxiciteit17 en beperkt tot kleine monstervolumes. In inspann…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering van de Amerikaanse National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 en R01DK114506) en het Amerikaanse ministerie van defensie (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) wordt sterk erkend.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
Referências
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing–cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
