כתב יד זה מתאר שיטת הקפאה נטולת קרח עבור כמויות גדולות של החולדות החצציטים לפיה התאים הראשוניים הם טרום מודבטים עם סוכנים הקפאה בריכוז נמוך והוא מוקשה בטיפות גדולות.
ויטריפיקציה היא חלופה מבטיחה ללא קרח להקפאה קלאסית (בקירוב 1 ° c/דקות) הקפאה של דגימות ביולוגיות. ויטריפיקציה דורש שיעורי צינון מהיר במיוחד כדי להשיג מעבר של מים לשלב הזכוכית תוך הימנעות היווצרות קרח מזיק. למרות שטרום הדגירה עם סוכנים ביולוגיים (CPA) יכול להפחית את שיעור הצינון הקריטי של דגימות ביולוגיות, ריכוזים גבוהים בדרך כלל נדרשים כדי לאפשר הקפאת קרח חינם על ידי ויטריפיקציה. כתוצאה מכך, ויטריפיקציה מושפע מרעילות CPA ומוגבלת לדגימות קטנות שניתן לקרר במהירות. לאחרונה הפגינו כי אלה מגבלות הטבועה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה בצובר. באמצעות שיטה זו הרומן, התאים הם הראשונים לקדם מחדש עם ריכוז הרואה חשבון נמוך תאיים. מינוף התייבשות אוסמוטי מהירה, ה-CPA תאיים מרוכז ישירות לקראת ויטריפיקציה, ללא צורך באופן מלא ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות הסלולר מבוצעת במכשיר פלואידיג ומשולב עם הדור תפוקה גבוהה רציפה של טיפות בגודל גדול כי הם התמסדים בחנקן נוזלי. שיטת הקפאת הקרח ללא הקפאה עם רעילות CPA מינימלית מתאימה לכמויות התאים הגדולות והתוצאות בכדאיות המוגברת של המעי האטי ובתפקוד המטבולית לעומת הקריוגנית איטית ומקפיאה. כתב יד זה מתאר את השיטות עבור droplet בצובר מוצלחת ויטריפיקציה בפירוט.
הפסד של הכדאיות התאית ותפקוד מטבולית לאחר קריוגנית של hepatocytes עדיין בעיה מרכזית המגבילה יישומים קליניים1,2,3. שיטת בחינת הסדר של ההיפציט הקריוגנית היא איטית-הקפאה, אשר מבוצעת על ידי הפרה מראש של hepatocyte עם CPA (diמתיל סולפוקסיד [dmso], גלוקוז, ו-אלבומין, הקפאת קצב מבוקרת (בקירוב 1 ° c/min) כדי ל טמפרטורות קריוגניים4,5. למרות מיטובי הדיווחים רבים, הרעלת רואי חשבון ביחד עם חוסר איזון אוסמוטי מזיק במהלך הקפאת הלחץ מכני של היווצרות קרח להישאר החסרונות הבסיסיים של קיפאון איטי6,7.
ויטריפיקציה מציע יתרון על הקפאה איטית בפציעה זו בשל היווצרות קרח הוא נמנע לחלוטין על ידי מעבר שלב ישיר של מים למצב זכוכית6. עם זאת, כדי להגיע לטמפרטורת המעבר זכוכית של מים טהורים (-137 ° c), המים חייבים להיות מקורר במחירים בסדר של 1,000,000 מעלות צלזיוס לשנייה (כלומר, שיעור צינון קריטי) כדי למנוע היווצרות קרח מעל טמפרטורת המעבר זכוכית8 . תוספת של CPAs יכול להקטין את שיעור הקירור הקריטי ולהגדיל את טמפרטורת המעבר זכוכית של פתרונות מימית9. עם זאת, גם עם ריכוזי CPA גבוהה (למשל, 40% v/v dmso או גבוה יותר) שיעורי צינון מהיר בכל זאתנדרשים עבור ויטריפיקציהמוצלחת 8,9.
תעריפי הצינון הנדרשים וריכוזי רואי חשבון גבוהים גורמים לשני החסרונות העיקריים של ויטריפיקציה. ראשית, כדי לאפשר קירור מהיר, הדגימות חייב להיות מסה תרמית נמוכה. שנית, כדי להגיע לריכוזי רואי חשבון גבוהים תוך הימנעות מפציעה אוסמוטי, CPAs חייב להיות לאט הציג ומוקצב מלא בין התאים הפנים והחילוץ6. זה מגביר את זמן החשיפה של תאים CPAs רעילים. יחד, הדבר גורם לויטריפיקציה תהליך מסורבל המוגבל למספר דוגמאות קטנות (מיקרוליטר) בכל פעם. מויטריפיקציה Droplet הוצע כפתרון פוטנציאלי להגבלות אלה. על-ידי חשיפת מזערית התאים טיפות (nanoliters) כדי חנקן נוזלי שיעור הקירור הוא גדל באופן משמעותי, אשר כתוצאה מכך מאפשר הפחתה ניכרת בריכוז רואי החשבון10,11,12 ,13,14. למרות שניתן להשתמש בו זמנית במספר רב של החרירים בתדר גבוה, גודל ה-droplet הקטן ביותר מגביל את התפוקה למיקרו-ליטר לדקה10, המונע הויטריפיקציה יעילה של תא גדול אמצעי אחסון עם קצבי עיבוד גניטודות גבוהים יותר לפי סדר מיליליטר לדקה.
לאחרונה הוכח כי אלה מגבלות הטבועה של ויטריפיקציה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה15בצובר. זו שיטה הרומן ממנף התייבשות אוסמוטי מהירה כדי לרכז את הריכוז של רואי חשבון תאיים של 7.5% v/v אתילן גליקול ו DMSO מיד לפני ויטריפיקציה, ביטול הצורך של היכולת המלאה של ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות תאית מבוצעת במכשיר פלואידיג באמצעות חשיפה קצרה של hepatocytes לריכוז הרואי חשבון גבוהה. למרות חשיפה זו גורמת התייבשות אוסמוטי מהירה, זה קצר מדי עבור ריכוז CPA גבוה כדי לפזר לתוך התאים. מיד לאחר התייבשות, התאים נטענים טיפות כי הם באופן ישיר בחנקן נוזלי. שיטה זו מבטלת את הצורך של ספיגת מלאה תאיים של ריכוזי CPA גבוהים בעוד ריכוז רואי חשבון גבוהה מאפשר ויטריפיקציה של טיפות בגודל גדול, וכתוצאה מכך נפח תפוקה גבוהה עם רעילות CPA מינימלית.
מויטריפיקציה Droplet משפרת את הכדאיות הישירה והארוכת-טווח לאחר שימור, כמו גם מורפולוגיה ותפקוד מטבולי של החולדה הראשית לעומת הקריוגנית קלאסית בהקפאה איטית15. כתב יד זה מספק את הפרטים מתודולוגיים עבור droplet גורפת ויטריפיקציה של החולדה הראשית העכבר.
הקפאת ההזמנה של hepatocytes על ידי הקפאה איטית תוצאות הכדאיות מופחתת פונקציה מטבולית. ויטריפיקציה מציעה חלופה מבטיחה לקריוגנית קלאסית, כאשר הפציעה הקפואה נמנעת לחלוטין9. עם זאת, טרום דגירה עם CPAs נדרש כדי להקטין את קצב הקירור הקריטי8. כתוצאה מכך, הויטריפיקציה מהרעילות ש…
The authors have nothing to disclose.
מימון ממוסדות הבריאות הלאומיים של ארה ב (R01DK096075, R01DK107875, R01DK114506) ומשרד ההגנה של ארה ב (משרד הבטחון RTRP W81XWH-17-1-0680) מודה מאוד.
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |