प्राथमिक हेप्टोसाइट संरक्षण के लिए थोक ड्रॉपलेट Vitrification
Summary
इस पांडुलिपि चूहे hepatocytes की बड़ी मात्रा के लिए एक बर्फ मुक्त cryopservation विधि का वर्णन है जिससे प्राथमिक कोशिकाओं को एक कम एकाग्रता पर क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों के साथ पूर्व इनक्यूबेट कर रहे हैं और बड़ी बूंदों में vitrified.
Abstract
Vitrification क्लासिक धीमी गति से फ्रीजिंग के लिए एक आशाजनक बर्फ मुक्त विकल्प है (लगभग 1 डिग्री सेल्सियस /मिनट पर) जैविक नमूनों के cryopservation. Vitrification बहुत तेजी से ठंडा दरों की आवश्यकता है कांच चरण में पानी के संक्रमण को प्राप्त करने के लिए, जबकि हानिकारक बर्फ गठन से परहेज. हालांकि क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों (सीपीए) के साथ पूर्व ऊष्मायन जैविक नमूनों की महत्वपूर्ण शीतलन दर को कम कर सकते हैं, उच्च सांद्रता आम तौर पर vitrification द्वारा बर्फ मुक्त cryopservation सक्षम करने के लिए आवश्यक हैं। एक परिणाम के रूप में, vitrification सीपीए विषाक्तता से बाधित है और छोटे नमूने है कि तेजी से ठंडा किया जा सकता करने के लिए प्रतिबंधित. यह हाल ही में दिखा दिया गया था कि इन निहित सीमाओं थोक छोटी बूंद vitrification द्वारा दूर किया जा सकता है. इस उपन्यास विधि का उपयोग करना, कोशिकाओं को पहले एक कम intracellular सीपीए एकाग्रता के साथ पूर्व incubated हैं. तेजी से परासरणी निर्जलीकरण का लाभ उठाते हुए, इंट्रासेल्यूलर सीपीए सीधे vitrification से आगे केंद्रित है, पूरी तरह से विषाक्त सीपीए सांद्रता को बराबर करने की आवश्यकता के बिना। सेलुलर निर्जलीकरण एक तरल डिवाइस में किया जाता है और तरल नाइट्रोजन में काटी हुई बड़ी आकार की बूंदों के निरंतर उच्च थ्रूपुट पीढ़ी के साथ एकीकृत किया जाता है। कम से कम सीपीए विषाक्तता के साथ इस बर्फ मुक्त cryopservation विधि बड़ी सेल मात्रा के लिए उपयुक्त है और शास्त्रीय धीमी गति से फ्रीजिंग cryopservation की तुलना में वृद्धि हुई hepatocyte व्यवहार्यता और चयापचय समारोह में परिणाम. इस पांडुलिपि में सफल थोक छोटी बूंद vitrification के लिए तरीकों का विस्तार से वर्णन करता है.
Introduction
hepatocytes के क्रायोपोसाइटेस के क्रायोपोकेशनके बाद कोशिका व्यवहार्यता और चयापचय समारोह की हानि अभी भी एक प्रमुख मुद्दा है जो नैदानिक अनुप्रयोगोंकोसीमित करता है 1 ,2,3. हेपेटोसाइट क्रायोपोकेंसी की बेंचमार्क विधि धीमी गति से फ्रीजिंग है, जो सीपीए (डिमेथिल सल्फाइड [डीएमएसओ], ग्लूकोज, और एल्बुमिन) और बाद में नियंत्रित दर ठंड (लगभग 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट पर) के साथ हेपेटोसाइट्स को पूर्व-इनक्यूबेट करके किया जाता है। क्राइरोजेनिक तापमान4,5. कई सूचित अनुकूलन के बावजूद, सीपीए विषाक्तता ठंड और बर्फ के गठन के यांत्रिक तनाव के दौरान हानिकारक परासरणी असंतुलन के साथ एक साथ धीमी गति से फ्रीजिंग6,7के मौलिक कमियां बनी हुई है।
विट्रीकरण बर्फ के गठन के कारण धीमी गति से ठंड पर एक लाभ प्रदान करता है कि कांच राज्य6में पानी के एक सीधा चरण संक्रमण से पूरी तरह से बचा जाता है। हालांकि, शुद्ध पानी (-137 डिग्री सेल्सियस) के कांच संक्रमण तापमान तक पहुंचने के लिए, पानी को कांच के संक्रमण तापमान 8 के ऊपर बर्फ के गठन से बचने के लिए प्रति सेकंड एक मिलियन डिग्री सेल्सियस (यानी, महत्वपूर्ण शीतलन दर) के क्रम में दरों पर ठंडा किया जाना चाहिए . सीपीए के अलावा महत्वपूर्ण शीतलन दर को कम कर सकते हैं और जलीय समाधान9के कांच संक्रमण तापमान में वृद्धि कर सकते हैं। हालांकि, यहां तक कि उच्च सीपीए सांद्रता के साथ (उदाहरण के लिए, 40% v/v DMSO या अधिक) तेजी से ठंडा दर फिर भी सफल vitrification के लिए आवश्यक हैं8,9.
आवश्यक ठंडा दरों और उच्च सीपीए सांद्रता vitrification के दो प्रमुख कमियों में परिणाम. सबसे पहले, तेजी से ठंडा सक्षम करने के लिए, नमूने एक कम थर्मल द्रव्यमान होना चाहिए. दूसरा, उच्च सीपीए सांद्रता तक पहुँचने के लिए, जबकि परासरणी चोट से बचने के लिए, CPA धीरे धीरे शुरू की और पूरी तरह से इंट्रा और extracellular डिब्बों के बीच समानीकृत किया जाना चाहिए6. यह विषाक्त CPAs के लिए कोशिकाओं के जोखिम समय बढ़ जाती है. साथ में, यह vitrification एक बोझिल प्रक्रिया है कि एक समय में कुछ छोटे आकार के नमूने (माइक्रोलीटर) तक सीमित है बनाता है. इन प्रतिबंधों के संभावित समाधान के रूप में ड्रॉपलेट विट्रेाइजेशन का प्रस्ताव किया गया है। नाइट्रोजन को तरल करने के लिए miniscule सेल से लदी बूंदों (nanoliters) को उजागर करके ठंडा दर काफी बढ़ जाती है, जिसके परिणामस्वरूप सीपीए एकाग्रता में काफी कमी की अनुमति देता है10,11,12 ,13,14. हालांकि कई उच्च आवृत्ति छोटी बूंद पैदा नलिका संभावित रूप से एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, अत्यंत छोटे छोटी बूंद आकार प्रति मिनट microliters के लिए थ्रूपुट सीमा10, जो बड़े सेल के कुशल vitrification precludes प्रति मिनट milliliters के आदेश पर परिमाण के साथ उच्च प्रसंस्करण दर के साथ संस्करणों.
हाल ही में यह प्रदर्शित किया गया था कि विरीकरण की इन अंतर्निहित सीमाओं को थोक बूंद विट्रीफिकेश15से दूर किया जा सकता है . इस उपन्यास विधि तेजी से osmotic निर्जलीकरण का लाभ उठाने के लिए एक intracellular सीपीए एकाग्रता ध्यान केंद्रित करने के लिए 7.5% v/v ethylene ग्लाइकोल और DMSO तुरंत पूर्ववर्ती vitrification, विषाक्त सीपीए सांद्रता के पूर्ण तुल्यता की आवश्यकता को नष्ट करने. सेलुलर निर्जलीकरण एक उच्च extracellular सीपीए एकाग्रता के लिए hepatocytes के एक संक्षिप्त जोखिम द्वारा एक fluidic डिवाइस में किया जाता है. हालांकि इस जोखिम तेजी से osmotic निर्जलीकरण का कारण बनता है, यह उच्च सीपीए एकाग्रता के लिए कोशिकाओं में फैलाना बहुत छोटा है. निर्जलीकरण के तुरंत बाद, कोशिकाओं को सीधे तरल नाइट्रोजन में काटी जाती हैं जो बूंदों में लोड होते हैं। इस विधि उच्च सीपीए सांद्रता के पूर्ण intracellular तेज की जरूरत समाप्त जबकि उच्च extracellular सीपीए एकाग्रता बड़े आकार की बूंदों के vitrification सक्षम बनाता है, कम से कम सीपीए विषाक्तता के साथ उच्च थ्रूपुट मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप.
Droplet vitrification संरक्षण के बाद प्रत्यक्ष और दीर्घकालिक व्यवहार्यता में सुधार, साथ ही साथ आकृति विज्ञान और प्राथमिक चूहे hepatocytes के चयापचय समारोह के रूप में धीमी गति से फ्रीजिंग15द्वारा शास्त्रीय cryopservation की तुलना में. इस पांडुलिपि प्राथमिक चूहे hepatocytes के थोक छोटी बूंद vitrification के लिए methodological विवरण प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
कम व्यवहार्यता और चयापचय समारोह में धीमी गति से ठंड परिणाम द्वारा hepatocytes के Cryopservation. Vitrification क्लासिक cryopservation के लिए एक आशाजनक विकल्प प्रदान करता है, के रूप में ठंड चोट पूरी तरह से बचा है9. हालांकि, सीपीए क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से धन (R01DK096075, R01DK107875, और R01DK114506) और अमेरिकी रक्षा विभाग (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) बहुत स्वीकार किया है.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
Referências
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing–cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
