Vitrificazione delle gocce di gocciolamento per la conservazione degli epatiti primari
Summary
Questo manoscritto descrive un metodo di crioconservazione senza ghiaccio per grandi quantità di epatociti di ratto per cui le cellule primarie sono pre-incubate con agenti crioprotettivi a bassa concentrazione e vetrificate in grandi goccioline.
Abstract
La vetrificazione è una promettente alternativa senza ghiaccio per la crioconservazione classica a freddo (a circa 1 omin/min) di campioni biologici. La vetrificazione richiede velocità di raffreddamento estremamente veloci per ottenere la transizione dell’acqua nella fase del vetro, evitando la formazione dannosa di ghiaccio. Sebbene la pre-incubazione con agenti crioprotettivi (CPA) possa ridurre il tasso di raffreddamento critico dei campioni biologici, sono generalmente necessarie elevate concentrazioni per consentire la crioconservazione senza ghiaccio mediante vitrificazione. Di conseguenza, la vetrificazione è ostacolata dalla tossicità della CPA e limitata a piccoli campioni che possono essere raffreddati rapidamente. Recentemente è stato dimostrato che questi limiti intrinseci possono essere superati dalla vetrificazione delle gocce di gocciolamento. Utilizzando questo nuovo metodo, le cellule vengono prima pre-incubate con una bassa concentrazione di CPA intracellulare. Sfruttando una rapida disidratazione osmotica, il CPA intracellulare è concentrato direttamente prima della vitrificazione, senza la necessità di equilibrare pienamente le concentrazioni di CPA tossiche. La disidratazione cellulare viene eseguita in un dispositivo fluido e integrata con la generazione continua ad alta velocità effettiva di goccioline di grandi dimensioni che sono vetrificate in azoto liquido. Questo metodo di crioconservazione senza ghiaccio con tossicità CPA minima è adatto per grandi quantità di cellule e si traduce in una maggiore vitalità epatocite e funzione metabolica rispetto alla crioconservazione classica a congelamento lento. Questo manoscritto descrive in dettaglio i metodi per il successo della vetrificazione delle gocce di gocciolamento.
Introduction
La perdita di vitalità cellulare e funzione metabolica dopo la crioconservazione degli epatociti è ancora un problema importante che limita le applicazioni cliniche1,2,3. Il metodo di riferimento della crioconservazione dell’epatocito è il congelamento lento, che viene eseguito pre-incubando gli epatociti con CPA (solfuro dimetilo [DMSO], glucosio e albumina) e il successivo congelamento del tasso controllato (a circa 1 temperature criogeniche4,5. Nonostante molte ottimizzazioni segnalate, tossicità CPA insieme a squilibri osmotici dannosi durante il congelamento e lo stress meccanico della formazione del ghiaccio rimangono svantaggi fondamentali di congelamento lento6,7.
La vetrificazione offre un vantaggio rispetto al congelamento lento in quanto la lesione dovuta alla formazione di ghiaccio è completamente evitata da una transizione di fase diretta dell’acqua nello stato del vetro6. Tuttavia, per raggiungere la temperatura di transizione del vetro di acqua pura (-137 gradi centigradi), l’acqua deve essere raffreddata a velocità nell’ordine di un milione di gradi Celsius al secondo (cioè la velocità di raffreddamento critica) per evitare la formazione di ghiaccio al di sopra della temperatura di transizione del vetro8 . L’aggiunta di CPA può ridurre la velocità di raffreddamento critica e aumentare la temperatura di transizione del vetro delle soluzioni acquose9. Tuttavia, anche con elevate concentrazioni di CPA (ad esempio, 40% v/v DMSO o superiore) i tassi di raffreddamento rapido sono comunque necessari per il successo della vitrificazione8,9.
I tassi di raffreddamento richiesti e le elevate concentrazioni di CPA provocano due importanti inconvenienti della vetrificazione. In primo luogo, per consentire un raffreddamento rapido, i campioni devono avere una massa termica bassa. In secondo luogo, per raggiungere elevate concentrazioni di CPA evitando lesioni osmotiche, i CPA devono essere lentamente introdotti ed equilibrati completamente tra i compartimenti intra-eextracellulari6. Questo aumenta il tempo di esposizione delle cellule alle CPA tossiche. Insieme, questo rende la vitrificazione un processo ingombrante che è limitato a pochi campioni di piccole dimensioni (microlitri) alla volta. Il vetrificazione delle goccioline è stata proposta come una potenziale soluzione a tali restrizioni. Esponendo piccole goccioline cariche di cellule (nanolitri) all’azoto liquido, il tasso di raffreddamento è notevolmente aumentato, il che consente di conseguenza una notevole riduzione della concentrazione di CPA10,11,12 ,13,14. Anche se più ugelli che generano gocciolette ad alta frequenza potrebbero potenzialmente essere utilizzati simultaneamente, la dimensione estremamente ridotta delle gocciolamenti limita la velocità effettiva ai microlitri al minuto10, il che preclude una vetrificazione efficiente delle grandi cellule volumi con grandi quantità di tassi di lavorazione più elevati nell’ordine dei millilitri al minuto.
Recentemente è stato dimostrato che questi limiti intrinseci di vetrificazione possono essere superati da vetrificazione gocciolamento alla rinfusa15. Questo nuovo metodo sfrutta la rapida disidratazione osmotica per concentrare una concentrazione intracellulare di CPA del 7,5% v/v glicole di etilene e DMSO immediatamente prima della vitrificazione, eliminando la necessità di un completo equilibrato di concentrazioni di CPA tossici. La disidratazione cellulare viene eseguita in un dispositivo fluido da una breve esposizione degli epatociti a un’alta concentrazione extracellulare di CPA. Anche se questa esposizione provoca una rapida disidratazione osmotica, è troppo breve per l’alta concentrazione di CPA per diffondersi nelle cellule. Immediatamente dopo la disidratazione, le cellule vengono caricate in goccioline che sono direttamente vetrificate in azoto liquido. Questo metodo elimina la necessità di un assorbimento intracellulare completo di alte concentrazioni di CPA, mentre l’elevata concentrazione extracellulare di CPA consente la vitrificazione di goccioline di grandi dimensioni, con conseguenti elevati volumi di throughput con una tossicità CPA minima.
La vetrificazione del vetrino delle gocce migliora la vitalità diretta e a lungo termine dopo la conservazione, così come la morfologia e la funzione metabolica degli epatociti del ratto primario rispetto alla crioconservazione classica con congelamento lento15. Questo manoscritto fornisce i dettagli metodologici per la vetrificazione delle gocce di rattociti primari.
Protocol
Representative Results
Discussion
La crioconservazione degli epatociti con congelamento lento si traduce in ridotta vitalità e funzione metabolica. La vetrificazione offre un’alternativa promettente per la crioconservazione classica, poiché il congelamento delle lesioni è completamente evitato9. Tuttavia, la pre-incubazione con CPA è necessaria per ridurre la velocità di raffreddamento critica8. Di conseguenza, la vetrificazione è ostacolata dalla tossicità CPA17 e limitata a …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I finanziamenti degli Stati Uniti National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 e R01DK114506) e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) sono molto riconosciuti.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
Referências
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