原発性肝細胞保存のためのバルク液滴ガラス化
Summary
この原稿は、一次細胞を低濃度で凍結保護剤で予インし、大きな液滴でガラス化するラット肝細胞を大量に採取する氷のない凍結保存法について説明する。
Abstract
ガラス化は、生物学的試料の古典的な低速凍結(約1°C/分)凍結のための有望な氷のない代替手段です。ガラス化は、有害な氷の形成を避けながら、ガラス相への水の移行を達成するために非常に高速な冷却速度を必要とします。凍結保護剤(CPA)によるプレインキュベーションは、生体試料の臨界冷却速度を低下させることができるが、ガラス化による氷のない凍結保存を可能にするためには、一般に高濃度が必要である。その結果、ガラス化はCPA毒性によって妨げられ、速く冷却することができる小さなサンプルに制限される。最近、これらの固有の制限はバルク液滴ガラス化によって克服できることが実証された。この新規な方法を用いて、細胞はまず低い細胞内CPA濃度でプレインキュベートされる。急速な浸透圧脱水を利用して、細胞内CPAは、完全に有毒なCPA濃度を平衡化する必要なしに、ガラス化の直接前に集中する。細胞脱水は流動装置で行われ、液体窒素中でガラス化される大きいサイズの液滴の連続的な高スループット生成と統合される。CPA毒性を最小限に抑えたこの氷のない凍結保存法は、大量の細胞に適しており、古典的な低速凍結凍結凍結保存と比較して肝細胞の生存率と代謝機能の増加をもたらす。この原稿は、バルク液滴ガラス化を成功させるための方法を詳細に説明する。
Introduction
肝細胞の凍結保存後の細胞生存率および代謝機能の喪失は、臨床応用を制限する大きな問題であり、1、2、3である。肝細胞凍結保存のベンチマーク法は、CPA(ジメチルスルホキシド[DMSO]、グルコース、アルブミン)およびその後の制御速度凍結(約1°/分)を用いて肝細胞を事前にインキュベートすることによって行われる、ゆっくりと凍結する。極低温4,5.多くの報告された最適化にもかかわらず、氷形成の凍結および機械的ストレス中の有害な浸透性不均衡と共にCPA毒性は、低速凍結6、7の根本的な欠点のままである。
ガラス化は、氷形成による傷害がガラス状態6への水の直接相転移によって完全に回避されるという点で、凍結が遅いよりも優位性を提供する。しかし、純水のガラス転移温度(-137°C)に達するには、水が毎秒100万°C(すなわち、臨界冷却速度)の速度で冷却され、ガラス転移温度を超える氷の形成を避ける必要があります。.CPAを添加すると、臨界冷却速度を低下させ、水溶液9のガラス転移温度を上昇させることができる。しかし、CPA濃度が高い場合でも(例えば、40%v/v DMSO以上)高速冷却速度は、それにもかかわらず、ガラス化を成功させるために必要とされる8、9である。
必要な冷却速度と高いCPA濃度は、ガラス化の2つの主要な欠点をもたらす。まず、高速冷却を可能にするには、サンプルの熱質量が低い必要があります。第二に、浸透圧損傷を回避しながら高いCPA濃度に達するためには、CPAをゆっくりと導入し、細胞外コンパートメント6の間で完全に平衡化しなければならない。これにより、細胞の有毒なCPAへの暴露時間が増加します。この結果、ガラス化は、一度に少数の小さなサイズのサンプル(マイクロリットル)に限定される面倒なプロセスになります。液滴ガラス化は、これらの制限に対する潜在的な解決策として提案されている。微小細胞を含む液滴(ナノリットル)を液体窒素に曝露することにより、冷却速度が著しく増加し、その結果、CPA濃度10、11、12の大幅な低下が可能になる。、13、14.複数の高周波液滴発生ノズルを同時に使用する可能性がありますが、非常に小さな液滴サイズは、10分あたりのマイクロリットルにスループットを制限し、大きなセルの効率的なガラス化を妨げます。毎分ミリリットルの順序で処理速度が大きい容積。
近年、これらの固有のガラス化の限界はバルク液滴ガラス化15によって克服できることが実証された。この新しい方法は、急速な浸透圧脱水を利用して、ガラス化直前の7.5%v/v/vエチレングリコールおよびDMSOの細胞内CPA濃度を濃縮し、有毒CPA濃度の完全な平衡化の必要性を排除する。細胞脱水は、高い細胞外CPA濃度に肝細胞を短時間曝露することによって流体装置で行われる。この暴露は急速な浸透脱水を引き起こすが、高いCPA濃度が細胞に拡散するには短すぎる。脱水直後、細胞は液体窒素中で直接ガラス化された液滴にロードされる。この方法は、高い細胞外CPA濃度が大きなサイズの液滴のガラス化を可能にし、最小限のCPA毒性で高スループットボリュームをもたらす一方で、高いCPA濃度の完全な細胞内取り込みの必要性を排除します。
液滴ガラス化は、保存後の直接的および長期的な生存率を改善するだけでなく、遅凍結15による古典的凍結保存と比較して原発性ラット肝細胞の形態および代謝機能を改善する。この原稿は、原発性ラット肝細胞のバルク液滴ガラス化のための方法論的詳細を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
凍結が遅い肝細胞の凍結保存は、生存率および代謝機能の低下をもたらす。凍結傷害は完全に避けられているので、ガラス化は、古典的な凍結保存のための有望な代替手段を提供しています9.しかしながら、CPAによる事前インキュベーションは、臨界冷却速度8を下げる必要がある。その結果、ガラス化はCPA毒性17によって妨げられ、少量?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
米国国立衛生研究所(R01DK096075、R01DK107875、R01DK114506)および米国国防総省(DoD RTRP W81XWH-17-1-0680)からの資金提供は大いに認めされています。
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
Referências
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