Bulk dråpe vitrifikasjon for primær hepatocytter bevaring
Summary
Dette manuskriptet beskriver en isfri kryonisk bevaring metode for store mengder rotte hepatocytter der primære celler er pre-inkubert med cryoprotective agenter på en lav konsentrasjon og vitrified i store dråper.
Abstract
Vitrifikasjon er et lovende isfritt alternativ for klassisk langsom frysing (ved ca. 1 ° c/min) kryonisk bevaring av biologiske prøver. Vitrifikasjon krever ekstremt raske kjølehastigheter for å oppnå overgangen av vann inn i glass fasen og samtidig unngå skadelig isdannelse. Selv om pre-inkubasjons med cryoprotective agenter (CPA) kan redusere den kritiske kjøle hastigheten av biologiske prøver, høye konsentrasjoner er vanligvis nødvendig for å aktivere isfri kryonisk bevaring ved vitrifikasjon. Som et resultat, vitrifikasjon er hemmet av CPA toksisitet og begrenset til små prøver som kan kjøles raskt. Det ble nylig demonstrert at disse iboende begrensningene kan overvinnes ved bulk dråpe vitrifikasjon. Ved hjelp av denne romanen metoden, celler er første pre-inkubert med en lav intracellulære CPA konsentrasjon. Ved å utnytte hurtig osmotisk dehydrering, er intracellulære-CPA konsentrert rett foran vitrifikasjon, uten å måtte fullt likevekt giftige CPA-konsentrasjoner. Den cellulære dehydrering er utført i en fluidic enhet og integrert med kontinuerlig høy gjennomstrømning generasjon av store størrelser dråper som er vitrified i flytende nitrogen. Denne isen-fri kryonisk bevaring metoden med minimal CPA toksisitet er egnet for store celle mengder og resulterer i økt hepatocytter levedyktighet og metabolsk funksjon i forhold til klassisk langsom frysing kryonisk bevaring. Dette manuskriptet beskriver metodene for vellykket bulk dråpe vitrifikasjon i detalj.
Introduction
Tap av celle levedyktighet og metabolsk funksjon etter kryonisk bevaring av hepatocytter er fortsatt et stort problem som begrenser kliniske anvendelser1,2,3. Den benchmark metoden for hepatocytter kryonisk bevaring er langsom frysing, som er utført av pre-incubating hepatocytter med CPA (dimethyl sulfoxide [DMSO], glukose, og albumin) og påfølgende kontrollert hastighet frysing (ved ca 1 ° c/min) til kryogene temperaturer4,5. Til tross for mange rapporterte optimaliseringer, CPA toksisitet sammen med skadelig osmotisk ubalanser under frysing og mekanisk stress av isen formasjon fortsatt grunnleggende ulempene ved langsom frysing6,7.
Vitrifikasjon tilbyr en fordel over langsom frysing i at skaden på grunn av isdannelse er helt unngås ved en direkte faseovergang av vann i glass staten6. Men for å nå glasset overgangen temperatur på rent vann (-137 ° c), må vannet avkjøles ved hastigheter i den rekkefølgen av 1 000 000 grader Celsius per sekund (dvs. kritisk kjøle hastighet) for å unngå isdannelse over glasset overgangen temperatur8 . Tilsetting av CPAs kan senke den kritiske kjøle hastigheten og øke glass overgangen temperatur på vandige løsninger9. Men selv med høye CPA konsentrasjoner (f. eks, 40% v/v DMSO eller høyere) rask kjøling priser er likevel nødvendig for vellykket vitrifikasjon8,9.
De nødvendige avkjølings ratene og høye CPA-konsentrasjonene resulterer i to store ulemper ved vitrifikasjon. Først, for å muliggjøre rask kjøling, må prøvene ha en lav termisk masse. For det andre, å nå høye CPA konsentrasjoner samtidig unngå osmotisk Kader, CPAs må langsomt innføres og fullt equilibrated mellom intra-og ekstracellulære rom6. Dette øker eksponeringstiden av celler til giftig CPAs. Sammen gjør dette vitrifikasjon en tungvint prosess som er begrenset til noen små store prøver (mikroliter) om gangen. Dråpe vitrifikasjon har blitt foreslått som en potensiell løsning på disse restriksjonene. Ved å utsette minimale celle-Laden dråper (nanoliters) til flytende nitrogen kjøle hastigheten er betydelig økt, noe som følgelig gir en betydelig reduksjon i CPA-konsentrasjonen 10,11,12 ,13,14. Selv om flere avanserte dyser for høyfrekvent dråpe generering potensielt kan brukes samtidig, begrenser den ekstremt lille dråpestørrelsen gjennomstrømningen til mikroliter per minutt10, noe som utelukker effektiv vitrifikasjon av stor celle volumer med magnitudes høyere prosesserings rater på rekkefølgen av milliliter per minutt.
Nylig ble det demonstrert at disse iboende begrensninger av vitrifikasjon kan overvinnes ved bulk dråpe vitrifikasjon15. Denne romanen metoden utnytter rask osmotisk dehydrering å konsentrere en intracellulære CPA konsentrasjon av 7,5% v/v etylen glykol og DMSO umiddelbart foregående vitrifikasjon, eliminerer behovet for full likevekts av giftige CPA konsentrasjoner. Den cellulære dehydrering utføres i en fluidic enhet ved en kort eksponering av hepatocytter til en høy ekstracellulære CPA-konsentrasjon. Selv om denne eksponeringen forårsaker rask osmotisk dehydrering, er det for kort for den høye CPA-konsentrasjonen å spre inn i cellene. Umiddelbart etter dehydrering, er cellene lastet i dråper som er direkte vitrified i flytende nitrogen. Denne metoden eliminerer behovet for full intracellulære opptak av høye CPA-konsentrasjoner, mens den høye ekstracellulære-CPA-konsentrasjonen gjør det mulig å vitrifikasjon store størrelse dråper, noe som resulterer i høy gjennomstrømning volumer med minimal CPA toksisitet.
Dråpe vitrifikasjon forbedrer direkte og langsiktig levedyktighet etter bevaring, samt morfologi og metabolsk funksjon av primære rotte hepatocytter i forhold til klassisk kryonisk bevaring ved langsom frysing15. Dette manuskriptet gir metodisk detaljer for bulk dråpe vitrifikasjon av primær rotte hepatocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kryonisk bevaring av hepatocytter ved langsom frysing resulterer i redusert levedyktighet og metabolsk funksjon. Vitrifikasjon tilbyr et lovende alternativ for klassisk kryonisk bevaring, som frysing skade er helt unngått9. Men, pre-inkubasjons med CPAs er nødvendig for å senke den kritiske kjøle hastighet8. Følgelig blir vitrifikasjon hemmet av CPA-toksisitet17 og begrenset til små prøve volumer. I arbeidet med å overkomme disse begrensninge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering fra det amerikanske National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875, og R01DK114506) og det amerikanske Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) er sterkt anerkjent.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
Referências
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing–cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
