En protokol til 3D-visualisering af mikroskopiske vævsstrukturer ved hjælp af en X-ray specifik farvnings metode designet til røntgen-computertomografi præsenteres.
Vi demonstrerer en laboratoriebaseret metode, der kombinerer røntgen Mikroct og nanoCT med en specifik røntgen plet, som er rettet mod cellens cytoplasma. Den beskrevne protokol er nem at anvende, hurtig og velegnet til større bløddels prøver. Den præsenterede metodologi muliggør karakterisering af vigtige vævsstrukturer i tre dimensioner og påvises på en hel muse nyre. Multi Scale tilgang giver mulighed for at billede hele muse nyre og støtter udvælgelsen af yderligere mængder af interesse, som er erhvervet med højere opløsninger spænder ind i nanometer rækkevidde. Derved gengives bløddels morfologi med et tilsvarende detaljeringsniveau som de tilsvarende histologiske lysmikroskopi billeder. Dybere indsigt i 3D-konfigurationen af vævsstrukturer opnås uden at hæmme yderligere undersøgelser gennem histologiske metoder.
Fuld karakterisering af bløddels prøver kræver oplysninger om 3D-vævs mikrostrukturen. Den nuværende guld standard for analyse af bløddels prøver er histopatologi. Den vævs-og cellulære morfologi af præparatet udforskes i 2D inden for udvalgte områder af interesse (ROIs) ved hjælp af Optisk mikroskopi1. Denne metode har dog flere ulemper. Forberedelsen af prøven er tidskrævende, kompliceret, destruktiv og tilbøjelig til artefakter. De producerede mikroskopiske dias giver kun 2D-oplysninger parallelt med skære planet. Ofte er antallet af histologiske sektioner, som undersøges, begrænset på grund af tidsbegrænsninger2,3.
I de seneste år har området 3D histologi udviklet sig. Her er virtuelle vævs skiver fra ethvert ønsket rumplan tilgængelige. Dette giver mulighed for sporing af strukturer i hele prøven, hvilket fører til en dybere forståelse af 3D-vævs arkitekturen og strukturelle ændringer i forbindelse med forskellige patologier. Forskellige metoder er blevet udviklet for at opnå generering af 3D-volumen data. De spænder fra serielle-sektion baserede tilgange, som bruger enten lys eller elektronmikroskopi4,5,6,7,8, til blok-Face billeddannelse metoder, såsom episcopic 3D imaging eller blok-Face scanning elektronmikroskopi7,8,9. Alle de nævnte metoder omfatter imidlertid enten opdeling eller destruktion af prøven fuldstændigt, hvilket ikke giver mulighed for yderligere undersøgelser. Den opnåede opløsning er meget afhængig af, at skæreprocessen er tilbøjelig til artefakter som beskrevet i konventionel histologi. Disse metoder lider også fra tilpasning artefakter.
3D X-ray Imaging teknikker såsom mikroskopisk og nanoskopisk computertomografi (microCT og nanoCT) stræber efter at generere 3D høj opløsning data uden ødelæggelse af vævsprøven. Indtil videre har den svage røntgen dæmpning kontrast af blødt væv og den begrænsede adgang til høje opløsninger i et laboratorium miljø forringet deres anvendelse til 3D-visualisering af mikroskopiske vævsstrukturer. Nylige fremskridt i retning af laboratoriebaseret, høj opløsning X-ray CT giver mulighed for opløsninger langt under 1 μm10,11,12,13.
Den manglende kontrast i blødt væv i konventionel dæmpnings baseret røntgenbillede kompenseres af farvnings midler, som forstærker kontrasten mellem røntgen dæmpningen. Farvnings midler, der kendes fra andre billedbehandlings teknikker såsom osmium dinitrogentetraoxid (OsO4), jod-kaliumiodid (Iki) eller phosphotungstinsyre (PTA), anvendes ofte14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Farvnings midler, der giver mulighed for (i) specifik biologisk målretning, (II) homogen og fuldstændig farvning, (III) nem håndtering, (IV) hurtig indtrængning af vævet uden at skabe artefakter såsom diffusions ringe, (v) stor og tæt vævs farvning, og (vi) fuld kompatibilitet med histopatologi er nødvendig for at etablere X-ray CT som værktøj til 3D-visualisering af mikroskopiske vævsstrukturer. I dette arbejde viser vi, hvordan bløddels prøver forberedes til røntgen CT-scanning med en cytoplasma-specifik røntgen plet baseret på eosin, der opfylder kravene anført ovenfor26.
Multi Scale Imaging-tilgangen sikrer vurdering af farvningskvalitet gennem en oversigt Mikroct måling og udvælgelse af mængder af interesse (VOIs) for yderligere undersøgelser med høj opløsning. Farvning kvalitet analyseres med fokus på farvning parametre såsom (i) fuldstændighed, (II) udseende af diffusions ringe, (III) kontrastforbedring, (IV) fremkomsten af CT artefakter såsom striber og (v) homogenitet. Den laboratoriebaserede nanoct-opsætning, som bruger geometrisk forstørrelse til at nå opløsninger ned til 100 nm, visualiserer bløddels morfologi på (sub)-cellulært niveau10,27. En komparativ analyse af Nanolt skiver med tilsvarende histologiske lys mikroskopi billeder bekræfter reproduktion af væv arkitektur med lignende detaljer på et mikroskopisk niveau i 2D, muliggør histopatologiske karakterisering af vævet Prøve. Denne detaljerede video protokol er beregnet til at øge bevidstheden og til at fremhæve potentialet i denne metode som ikke-destruktiv 3D Soft-tissue Imaging værktøj er af interesse for et bredt videnskabeligt samfund som zoologer, biologer og sundhed Fagfolk.
I øjeblikket, eosin anvendes som standard histologisk protokol til etiketten cellecytoplasmaet. Farvnings midlet påføres som en vandig opløsning på 0,1% (w/v) til mikroskopiske skiver af blødt væv (almindeligvis skåret med en tykkelse på 2-10 μm)33. Anvendelsen af denne standardiserede histologiske protokol til 3D vævsprøver såsom en hel mus nyre ikke resulterer i en dæmpning kontrast forbedret CT billede. På den ene side kan dette tilskrives de lave iboende dæmpningsegenskaber af blødt væv for typisk anvendte røntgen energier af laboratoriebaserede Mikroct-systemer. Normalt er blødt væv sammensat af hovedsageligt kulstof, brint, ilt og nitrogen34, og derfor ikke resulterer i kontrastforbedring. På den anden side var den lave koncentration af eosin, der anvendes til farvning, den begrænsende faktor. Selvom et eosin-molekyle har fire bromid-atomer (højt atomtal element bromin med Z = 3534), blev de følsomhedsniveauer, der kræves for røntgen CT-scanning, ikke opfyldt.
For at overvinde denne udfordring med lav dæmpnings kontrast blev flere koncentrationer af eosin undersøgt. En begrænsning er her den maksimale Opløselighed af eosin i vand, som er 30% (w/v) i en vandig opløsning. Bedste dæmpning kontrastforbedring inden for blødt væv blev observeret med den højeste eosin koncentration, som blev forventet i henhold til Lambert-Beer lov. Derfor blev den endelige farvnings protokol udført med den højeste koncentration.
Spørgsmålet om, hvordan man forbereder det bløde væv optimalt på et Molekylær niveau for farvnings proceduren for yderligere at forbedre kontrasten ekstraudstyr blev besvaret af pH justering. Her konstateredes det, at forsuring af bløddels prøven under fiksering eller før farvning blev fundet afgørende. Dette blev også vist af Hong et al.35. Den højere ophobning af farvningsmiddel i cellen cytoplasma af syren blev opnået gennem forbedrede Ioniske interaktioner, som var et resultat af protonation af aminosyre sidekæder af proteiner og peptider til stede i cellen cytoplasma. I figur 1a, bvises et repræsentativt resultat, der fremhæver kontrast forøgelsen sammenlignet med en ufarvet bløddels prøve. Her blev en strukturel oversigt over en hel mus nyre visualisering afgørende anatomiske regioner såsom cortex, medulla, papilla og renal bækken opnået.
Den præsenterede farvnings protokol er enkel at anvende og indeholder kun tre trin. De nødvendige reagenser er let tilgængelige. Den samlede farvnings periode på 24 timer er hurtig for en hel-organ farvning, som muliggør 3D-visualisering af bløddels prøver (figur 1c, figur 2b og figur 4b) i et laboratoriemiljø på flere skalaer ned til cellulært niveau. Det skal bemærkes, at den samlede farvnings tidspunkt og-volumen for den nødvendige farvningsopløsning kan anmode om visse tilpasninger afhængigt af prøvens art. Ikke desto mindre er den eosin-baserede farvning protokol egnet til hele organ farvning, som derefter muliggør højopløsnings Mikroct billeddannelse af hele organer. Svind artefakter på grund af den opløsningsmiddel ethanol, som blev brugt til at holde prøven fugtig under Mikroct målinger, blev ikke observeret. Yderligere forberedelse skridt er nødvendige for nanoCT Imaging, som giver mulighed for undersøgelse af mindre væv stykker hentet fra den oprindelige prøve. Med hensyn til fremtidige histopatologiske anvendelser vil oversigten scanninger give værdifuld indsigt i ændrede anatomiske regioner og strukturer, som giver mulighed for bestemmelse af ROIs som vist i figur 2a. Disse kan undersøges i 3D ved hjælp af microCT (figur 1c og figur 2b) eller nanoct (figur 4b) og evalueret i 2D med histologi (figur 3).
En anden styrke i protokollen ses i fuld overensstemmelse med histopatologi med hensyn til H & E farvnings proceduren. Anvendelsen af den eosin-baserede farvnings procedure på bulkprøver hæmmer ikke yderligere histologiske undersøgelser (figur 3), selv om den anvendte eosin-koncentration er meget højere sammenlignet med den histologiske farvningsopløsning. Nanoct skive med en virtuel tykkelse på ca. 400 nm (figur 3a) sammenligner allerede meget godt med den histologiske del (figur 3c), som blev afledt af den tilsvarende bløddels prøve. I betragtning af den omtrentlige tykkelse af en histologisk sektion med 7-10 μm giver genereringen af mindste intensitets projektion udsnit af nanoCT data (figur 3b), som svarer til en virtuel tykkelse på ca. 7 μm, mulighed for en bedre sammenligning med det histologiske afsnit (figur 3c). Her er cellekerner tydeligt afsløret som ikke-dæmpnings område, da eosin specifikt pletter proteiner og peptider i cellen cytoplasmaet33.
Det er muligt at anvende yderligere kontra farvning med standard histologiske metoder, selv om rækkefølgen af farvning i forhold til den normale histologiske farvnings procedure blev vendt. Starter først med den udviklede eosin-baserede farvnings protokol for CT, efterfulgt af Counter farvning af de eosin-baserede histologiske sektioner med hematoxylin, giver mulighed for fuld kompatibilitet og resulterer i en høj kvalitet farvning viser den forventede form af udseende. Cellekerner-specifik farvning med mayer’s sure hematoxylinlegemer blev anvendt til den histologiske sektion, der fremhæver cellekerner i lilla (figur 3d). Anvendelsen af histologisk Counter farvning er i øjeblikket begrænset til H-pletten. Andre standard histologiske modstande såsom periodisk syre Schiff base, Elastica van Gieson eller Gomori Silver skal evalueres samt kompatibiliteten med immun histologiske teknikker skal testes.
Den eosin-baserede farvnings protokol giver mulighed for (i) celle cytoplasma-specifik målretning, (II) homogen og fuldstændig farvning, (III) nem gennemførelse, (IV) hurtig penetration af vævet uden at skabe artefakter såsom diffusions ringe, (v) farvning af store og tætte bløddels prøver og (vi) fuld kompatibilitet med histopatologi med hensyn til H & E pletten. Disse krav er vigtige for at give høj opløsning X-ray CT visualisering af blødt væv ned til cellulært niveau. I kombination med de nyligt udviklede nanoct enheder12,36,37, ikke-destruktiv generering af virtuelle histologiske skiver, der er sammenlignelige i kontrast og opløsning til konventionelle histologiske data er gjort muligt. Denne kombinerede tilgang vil gøre det muligt at etablere X-ray CT som et værdifuldt værktøj til 3D-visualisering af mikroskopiske vævsstrukturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. enken Drecoll for histologiske diskussioner og det yderst hjælpsomme team hos Excillum AB, Sverige. Vi anerkender økonomisk støtte gennem DFG Cluster of Excellence München Center for Advanced Photonics (kort) og DFG Gottfried Wilhelm Leibniz program. Dette forskningsprojekt har desuden modtaget støtte fra eu’s Horizon 2020-forsknings-og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. HORISONT 2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |