Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem latente do tempo-lapso da pilha viva é uma ferramenta importante na biologia da pilha que fornece a introspecção em processos celulares que poderiam de outra maneira ser negligenciados, incompreendido, ou interpretado mal pela análise da fixo-pilha. Embora a imagem e a análise de células fixas sejam robustas e suficientes para observar o estado estacionário celular, ela pode ser limitada na definição de uma ordem temporal de eventos no nível celular e está mal equipada para avaliar a natureza transitória dos processos dinâmicos, incluindo progressão mitótica. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares a nível da único-pilha sobre o tempo e tem a capacidade capturar a dinâmica dos processos que seriam representados de outra maneira mal na imagem latente fixa da pilha. Aqui nós descrevemos uma aproximação para gerar as pilhas que carregam marcadores cDNAs etiquetados da cromatina e dos microtúbulos e seu uso em aproximações da imagem latente da pilha viva para monitorar o alinhamento do cromossoma da metafase e a saída mitotic. Nós descrevemos técnicas Imaging-Based para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic, incluindo a identificação das pilhas em vários estágios no mitosis, na identificação e no seguimento de defeitos mitotic, e na análise da dinâmica do eixo e destino de células mitóticas após o tratamento com inibidores mitóticos.
Introdução
A análise baseada em imagem de células fixas é comumente usada para avaliar as alterações de nível populacional de células em resposta a várias perturbações. Quando combinado com a sincronização de células, seguido pela coleta e imagem de pontos de tempo serial, essas abordagens podem ser usadas para sugerir uma seqüência de eventos celular. Não obstante, a imagem latente fixa da pilha é limitada que as relações temporais estão implícitas para uma população e não demonstrada a nível de pilhas individuais. Desta maneira, quando a imagem latente e a análise fixas da pilha forem suficientes observar fenótipos robustos e mudanças do estado estacionário, a habilidade de de....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. geração de células hTERT-RPE-1 que expressam estavelmente RFP-histona 2B (RFP-H2B) e α-tubulina-EGFP (Tub-EGFP)
Nota: todas as etapas seguem técnicas assépticas e acontecem em um gabinete de segurança de nível II + (BSL2 +) de biosseguridade.
- Gerar retrovírus carregando os genes do interesse (α-tubulin-EGFP e RFP-H2B) pelo transfection de 293T pilhas com os plasmídeos lentivirais apropriados de acordo com as instruções do fabricante do sistema lipídico-baseado da entrega do transfection.
- Dia 1: utilize uma pipeta Pasteur de vidro descartável para aspirar o meio de cultura celular a partir de uma placa de células de 293T....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Avaliação da progressão mitótica na presença de perturbações do fuso
O Regulamento do pólo do eixo que focalizando é uma etapa essencial na formação bipolar apropriada do eixo. Rompimento nesse processo por meio de depleções de proteínas, inibição de fármacos ou alterações no número centrosome corromper a estrutura do fuso e atrasar ou interromper a progressão mitótica10,11,12,13
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A resolução temporal fornecida pela imagem de lapso de tempo permite a visualização e avaliação de eventos celulares seqüenciais dentro de células individuais. Abordagens que fazem uso de sincronização celular seguido pela coleta e fixação de células em pontos de tempo seqüencial são limitadas em que as comparações são feitas em última análise entre as populações de células. Em contextos onde a resposta celular às perturbações pode ser não uniforme, ou onde o processo que está sendo visualizado é dinâmico, a imagem laten.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
DLM é apoiado por um NSF GRFP. O ALM é apoiado pelo financiamento do prêmio Smith Family de excelência em pesquisa biomédica.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina | Gibo-Life sciences | 25-510 | Uma serina protease usada para liberar células aderentes de placas de cultura |
| Tubos de centrífuga de 15ml | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objetivo | Nikon | Para uso em imagens de células vivas para visualizar tanto campo claro quanto fluorescência | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | Para uso em transfecção retroviral; usado na etapa 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | vários números | Vetor de expressão para tubulina alfa fundida a uma etiqueta de proteína fluorescente verde; para uso na visualização de tubulina em imagens de células vivas: disponível comercialmente através da addgene e outros fornecedores |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Inibidor de molécula pequena da quinase mitótica Aurora A. A concentração de estoque é preparada a 10mM em DMSO e usada em uma concentração final de 100nM. |
| Blasticidina | Invitrogen | A11139-03 | Agente de seleção de antibióticos; usado para selecionar células que expressam a-tub-EGFP |
| C02 | Airgas | Para uso em cultura de células e imagens de células vivas | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Conjunto de filtros de banda única; comprimento de onda de excitação 545nm com largura de banda de 25nm e emissão em comprimento de onda de 605nm com largura de banda de 70nm; para visualização de H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Conjunto de filtro de banda única; comprimento de onda de excitação 470nm com largura de banda de 40nm e emissão em comprimento de onda de 525nm com largura de banda de 50nm; para visualização de |
| pipetas de vidro descartáveis GFP-tubulina, esterilizadas | Fisher Scientific | 13-678-6A | Para uso em células aspirantes |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Meio de cultura celular para crescimento de células RPE-1 e 293T |
| Soro fetal bovino (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Suplemento de meio de cultura celular |
| Lipofectamine 3000 e p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Reagente de transfecção à base de lipídios para transfecção de plasmídeos; usado em placas de cultura de tecidos de poços múltiplos 1.1.4 |
| Corning | vários | para uso em cultura de células, transfecção/infecção e imagens de células vivas | |
| Microscópio Nikon Ti-E | Microscópio de epifluorescência invertida Nikon para uso em imagens de células vivas | ||
| Nikon | Versão 4.51 | Software de aquisição e análise de imagem; usado nas seções 3 e 4 | |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Meio de soro reduzido para transfecção celular; usado na etapa 1.1.3 |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiótico usado em meio de cultura |
| células tampão fosfato solução salina vermelha (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | solução salina estéril para uso com cultura de células |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G construção de expressão de envelope; usado na etapa 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Polímero catiônico usado para aumentar a eficiência da infecção viral; usado na etapa 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | plasmídeo de embalagem lentiviral de 2ª geração; usado na etapa 1.1.4 |
| Puromicina | Invitrogen | ant-pr-1 | Agente de seleção de antibióticos; usado para selecionar para células que expressam RFP-H2B |
| RFP- Histona 2B (H2B) | Addgene | vários números | Vetor de expressão para histona 2B marcada com proteína fluorescente vermelha; para uso na visualização da cromatina em imagens de células vivas: disponível comercialmente através da Addgene e outros fornecedores |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Reagente de transfecção à base de lipídios para transfecção de construções de siRNA |
| Células RPE-1 | ATCC | CRL-4000 | Linha de células epiteliais pigmentadas da retina humana |
| Placa de cultura de tecidos 100x20mm | Corning | 353003 | para uso na cultura de células aderentes |
| Zyla sCMOS camera | Câmera Nikon | conectada ao microscópio, usada para capturar imagens de células |
Referências
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochor....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
