यहाँ हम धुरी गठन और माइटोटिक प्रगति की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। समय चूक इमेजिंग के हमारे आवेदन उपयोगकर्ता mitosis के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सक्षम बनाता है, ट्रैक और माइटोटिक दोषों की पहचान, और विरोधी mitotic दवाओं के संपर्क में आने पर धुरी गतिशीलता और mitotic सेल भाग्य का विश्लेषण.
लाइव सेल समय चूक इमेजिंग सेल जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि सेलुलर प्रक्रियाओं है कि अन्यथा अनदेखी की जा सकती है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, गलत समझा, या निश्चित सेल विश्लेषण द्वारा गलत व्याख्या की. जबकि स्थिर सेल इमेजिंग और विश्लेषण मजबूत और सेलुलर स्थिर राज्य का पालन करने के लिए पर्याप्त है, यह सेलुलर स्तर पर घटनाओं की एक लौकिक क्रम को परिभाषित करने में सीमित किया जा सकता है और सहित गतिशील प्रक्रियाओं के क्षणिक प्रकृति का आकलन करने के लिए सुसज्जित है माइटोटिक प्रगति. इसके विपरीत, लाइव सेल इमेजिंग एक वाक्पटु उपकरण है कि समय के साथ एकल सेल स्तर पर सेलुलर प्रक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और प्रक्रियाओं की गतिशीलता है कि अन्यथा खराब निश्चित सेल इमेजिंग में प्रतिनिधित्व किया जाएगा पर कब्जा करने की क्षमता है. यहाँ हम एक दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए क्रोमैटिन और microtubules के फ्लोरोसेंट लेबल मार्करों ले जाने कोशिकाओं और लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण में उनके उपयोग मेटाफेज गुणसूत्र संरेखण और mitotic बाहर निकलने की निगरानी के लिए उत्पन्न करने के लिए. हम इमेजिंग आधारित तकनीकों का वर्णन धुरी गठन और माइटोटिक प्रगति की गतिशीलता का आकलन करने के लिए, mitosis में विभिन्न चरणों में कोशिकाओं की पहचान सहित, पहचान और माइटोटिक दोषों की ट्रैकिंग, और धुरी गतिशीलता का विश्लेषण और माइटोटिक इनहिबिटर के साथ उपचार के बाद माइटोटिक सेल भाग्य।
स्थिर कोशिकाओं का छवि-आधारित विश्लेषण आमतौर पर विभिन्न क्षोभ के प्रत्युत्तर में कोशिका जनसंख्या स्तर परिवर्तनों का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जब सेल तुल्यकालन के साथ संयुक्त, संग्रह और सीरियल समय अंक की इमेजिंग के बाद, इस तरह के दृष्टिकोण घटनाओं के एक सेलुलर अनुक्रम का सुझाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर भी, निश्चित सेल इमेजिंग कि लौकिक संबंधों में सीमित है एक जनसंख्या के लिए निहित हैं और व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर प्रदर्शन नहीं. इस तरह, जबकि निश्चित सेल इमेजिंग और विश्लेषण मजबूत phenotypes और स्थिर राज्य परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त है, समय के साथ क्षणिक परिवर्तन का पता लगाने की क्षमता और परिवर्तन है कि केवल कोशिकाओं की एक subpopulation प्रभाव अपूर्ण है. इसके विपरीत, लाइव सेल इमेजिंग एक वाक्पटु उपकरण है कि एक एकल सेल के भीतर सेलुलर और subcellular प्रक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या सेलुलर आबादी, समय के साथ और तुल्यकालन दृष्टिकोण है कि खुद सेलुलर व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं की सहायता के बिना 1 , २ , 3 , 4 , 5 , 6.
एक द्विध्रुवी माइटोटिक धुरी का गठन कोशिका विभाजन के दौरान उचित गुणसूत्र अलगाव के लिए आवश्यक है, जिसके परिणामस्वरूप दो आनुवंशिक रूप से समान बेटी कोशिकाओं में होती है। माइटोटिक तर्कु संरचना में दोष जो माइटोटिक प्रगति को भ्रष्ट करता है और गुणसूत्र पृथक्करण की निष्ठा से समझौता करता है, भयावह कोशिका विभाजन और कम सेल व्यवहार्यता में परिणाम कर सकता है। इस कारण से , तर्कु के गठन को बदलने वाले माइटोटिक जहर कैंसर कोशिकाओं के तेजी से प्रसार को सीमित करने के लिए चिकित्सा का वादा कर रहे हैं7,8,9. फिर भी, माइटोटिक जहर के अलावा के बाद धुरी संरचना का निश्चित सेल विश्लेषण धुरी गठन की गतिशील प्रक्रिया का आकलन करने की क्षमता में सीमित है और यह इंगित नहीं कर सकता है कि धुरी संरचना में देखे गए परिवर्तन स्थायी हैं या कर रहे हैं इसके बजाय क्षणिक और सफल सेल विभाजन की अनुमति के लिए दूर किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम लाइव सेल इमेजिंग द्वारा धुरी क्षोभ के बाद mitosis की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन. chTERT अमर RPE-1 सेल लाइन का उपयोग करने के लिए एक RFP-टैग्ड Histone 2B व्यक्त करने के लिए chromatin कल्पना करने के लिए इंजीनियर, एक EGFP-टैग्ड के साथ -tubulin microtubules कल्पना करने के लिए, मेटाफेज गुणसूत्र के समय, anaphase onset, और अंत में माइटोटिक सेल भाग्य गुणसूत्र आंदोलन, संहनन, और परमाणु आकृति विज्ञान के दृश्य संकेतों का उपयोग कर मूल्यांकन कर रहे हैं।
समय चूक इमेजिंग द्वारा प्रदान अस्थायी संकल्प दृश्य और एकल कोशिकाओं के भीतर अनुक्रमिक सेलुलर घटनाओं के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. दृष्टिकोण है कि सेलुलर तुल्यकालन का उपयोग करने के संग्रह और अनु?…
The authors have nothing to disclose.
डीएलएम एक NSF GRFP द्वारा समर्थित है. ALM जैव चिकित्सा अनुसंधान में उत्कृष्टता के लिए स्मिथ परिवार पुरस्कार से धन द्वारा समर्थित है.
0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |