미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징
Summary
여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.
Abstract
살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰은 그렇지 않으면 간과될 지도 모르다 세포 프로세스에 통찰력을 제공하는 세포 생물학에 있는 중요한 공구, 오해, 또는 고정세포 분석에 의해 오해될 수 있습니다. 고정 된 세포 이미징 및 분석은 세포 정상 상태를 관찰하기에 강력하고 충분하지만 세포 수준에서 이벤트의 시간적 순서를 정의하는 데 제한 될 수 있으며 다음과 같은 동적 프로세스의 일시적인 특성을 평가하기에 적합하지 않습니다. 유사 분열. 대조적으로, 살아있는 세포 화상 진찰은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 셀 방식 프로세스를 관찰하기 위하여 이용될 수 있고 그렇지 않으면 고정된 세포 화상 진찰에서 제대로 표현될 프로세스의 역학을 붙잡기 위하여 능력을 가지고 있는 웅변공구입니다. 여기에서 우리는 염색체와 microtubules의 형광표지마커및 살아있는 세포 화상 진찰 접근에 있는 그들의 사용을 운반하는 세포를 생성하는 접근을 메타페이즈 염색체 정렬 및 유사분열 출구를 감시하기 위하여 기술합니다. 우리는 유사분열의 다양한 단계에서 세포의 식별, 유사분열 결함의 식별 및 추적, 스핀들 역학의 분석을 포함하여 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 이미징 기반 기술을 설명하고, 유사분열 억제제로 치료 한 후 유사 분열 세포 운명.
Introduction
고정 된 세포의 이미지 기반 분석은 일반적으로 다양한 섭동에 반응하여 세포 집단 수준 변화를 평가하는 데 사용됩니다. 세포 동기화와 결합된 다음 직렬 시간 포인트의 수집 및 이미징을 수행하면 이러한 접근법을 사용하여 이벤트의 셀룰러 서열을 제안할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 고정된 세포 화상 진찰은 시간적인 관계가 인구를 위해 암시되고 개별 적인 세포의 수준에서 설명되지 않는다는 점에서 제한됩니다. 이런 식으로 고정 된 세포 이미징 및 분석은 강력한 표현형 및 정상 상태 변화를 관찰하기에 충분하지만 시간이 지남에 따라 일시적인 변화를 감지하고 세포의 하위 모집단에만 영향을 미치는 변화는 불완전합니다. 대조적으로, 살아있는 세포 화상 진찰은 단 하나 세포 내의 세포 및 세포 소 프로세스를 관찰하기 위하여 이용될 수 있는 웅변 공구, 또는 셀 방식 인구, 시간이 지남에 따라 그리고 그 자체가 세포 행동에 영향을 미칠 수 있는 동기화 접근의 원조 없이 1개 , 2개 , 3개 , 4개 , 5개 , 6.
양극성 유사분열 스핀들의 형성은 세포 분열 동안 적절한 염색체 분리에 필수적이며, 그 결과 두 개의 유전적으로 동일한 딸 세포가 생성됩니다. 유사분열 성 진행을 손상시키고 염색체 분리의 충실도를 손상시키는 유사분열 스핀들 구조의 결함은 치명적인 세포 분열과 세포 생존력을 감소시킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 스핀들 형성을 변화시키는 유사분열 독은암세포의급속한 증식을 제한하는 유망한 치료법7,8,9. 그럼에도 불구하고, 유사분열 독의 첨가에 따른 스핀들 구조의 고정 세포 분석은 스핀들 형성의 동적 과정을 평가하는 능력에 제한이 있으며, 스핀들 구조의 관찰된 변화가 영구적인지 또는 대신 일시적이며 성공적인 세포 분열을 허용하기 위해 극복 될 수있다.
이 프로토콜에서는, 우리는 살아있는 세포 화상 진찰에 의하여 스핀들 섭동을 따르는 유사분열의 역학을 평가하기 위하여 접근을 기술합니다. RFP 태그가 달린 히스톤 2B를 발현하기 위해 설계된 hTERT 불멸형 RPE-1 세포주를 사용하여 염색질을 시각화하고, EGFP 태그가 달린 α-tubulin과 함께 미세관을 시각화하고, 메타페이즈 염색체 정렬, 아나페이즈 발병의 타이밍을 시각화하고, 궁극적으로 유사분열 세포 운명은 염색체 운동, 다짐 및 핵 형태학의 시각적 단서를 사용하여 평가됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
타임랩스 이미징에 의해 제공되는 시간적 해상도는 단일 세포 내에서 순차적 세포 이벤트의 시각화 및 평가를 가능하게 합니다. 순차적 시점에서 세포의 수집 및 고정에 이어 세포 동기화를 사용하는 접근법은 궁극적으로 세포의 집단 간에 비교가 이루어진다는 점에서 제한적입니다. 섭동에 대한 세포 반응이 균일하지 않거나 시각화되는 프로세스가 동적인 상황에서, 라이브 셀 타임랩스 이미징…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM은 NSF GRFP에서 지원됩니다. ALM은 생물 의학 연구에 있는 우수성을 위한 스미스 가족 상에서 자금조달에 의해 지원됩니다.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
Referências
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
