Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.
Abstract
A imagem latente do tempo-lapso da pilha viva é uma ferramenta importante na biologia da pilha que fornece a introspecção em processos celulares que poderiam de outra maneira ser negligenciados, incompreendido, ou interpretado mal pela análise da fixo-pilha. Embora a imagem e a análise de células fixas sejam robustas e suficientes para observar o estado estacionário celular, ela pode ser limitada na definição de uma ordem temporal de eventos no nível celular e está mal equipada para avaliar a natureza transitória dos processos dinâmicos, incluindo progressão mitótica. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares a nível da único-pilha sobre o tempo e tem a capacidade capturar a dinâmica dos processos que seriam representados de outra maneira mal na imagem latente fixa da pilha. Aqui nós descrevemos uma aproximação para gerar as pilhas que carregam marcadores cDNAs etiquetados da cromatina e dos microtúbulos e seu uso em aproximações da imagem latente da pilha viva para monitorar o alinhamento do cromossoma da metafase e a saída mitotic. Nós descrevemos técnicas Imaging-Based para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic, incluindo a identificação das pilhas em vários estágios no mitosis, na identificação e no seguimento de defeitos mitotic, e na análise da dinâmica do eixo e destino de células mitóticas após o tratamento com inibidores mitóticos.
Introduction
A análise baseada em imagem de células fixas é comumente usada para avaliar as alterações de nível populacional de células em resposta a várias perturbações. Quando combinado com a sincronização de células, seguido pela coleta e imagem de pontos de tempo serial, essas abordagens podem ser usadas para sugerir uma seqüência de eventos celular. Não obstante, a imagem latente fixa da pilha é limitada que as relações temporais estão implícitas para uma população e não demonstrada a nível de pilhas individuais. Desta maneira, quando a imagem latente e a análise fixas da pilha forem suficientes observar fenótipos robustos e mudanças do estado estacionário, a habilidade de detectar mudanças transientes sobre o tempo e as mudanças que impactam somente um subpopulação das pilhas são imperfeitas. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares e subcellular dentro de uma única pilha, ou população celular, sobre o tempo e sem a ajuda de aproximações da sincronização que podem eles mesmos impactar o comportamento celular 1. º , 2. º , 3. º , 4. º , 5. º , a 6.
A formação de um eixo mitotic bipolar é essencial para a segregação apropriada do cromossoma durante a divisão da pilha, tendo por resultado duas pilhas genetically idênticas da filha. Os defeitos na estrutura mitotic do eixo que corromper a progressão mitotic e comprometer a fidelidade da segregação do cromossoma podem conduzir às divisões de pilha catastróficas e à viabilidade reduzida da pilha. Por esta razão, os venenos mitóticos que alteram a formação do fuso são terapêuticas promissoras para limitar a rápida proliferação das células cancerosas7,8,9. Não obstante, a análise fixa da pilha da estrutura do eixo que segue a adição de venenos mitotic é limitada em sua habilidade de avaliar o processo dinâmico da formação do eixo e não pode indicar se as mudanças observadas na estrutura do eixo são permanentes ou são em vez transiente e pode ser superado para permitir a divisão celular bem-sucedida.
Neste protocolo, nós descrevemos uma aproximação para avaliar a dinâmica do mitose que segue perturbações do eixo pela imagem latente viva da pilha. Usando o hTERT imortalized RPE-1 linha celular projetada para expressar um RFP-Tagged histona 2B para visualizar a cromatina, juntamente com um EGFP-Tagged α-tubulin para visualizar microtúbulos, o sincronismo do alinhamento do cromossomo metafase, início da anaphase, e, finalmente, o Fate da pilha mitotic é avaliado usando indicações visuais do movimento do cromossoma, da compactação, e da morfologia nuclear.
Protocol
Representative Results
Discussion
A resolução temporal fornecida pela imagem de lapso de tempo permite a visualização e avaliação de eventos celulares seqüenciais dentro de células individuais. Abordagens que fazem uso de sincronização celular seguido pela coleta e fixação de células em pontos de tempo seqüencial são limitadas em que as comparações são feitas em última análise entre as populações de células. Em contextos onde a resposta celular às perturbações pode ser não uniforme, ou onde o processo que está sendo visualizad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM é apoiado por um NSF GRFP. O ALM é apoiado pelo financiamento do prêmio Smith Family de excelência em pesquisa biomédica.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
Referências
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