细菌肽显示用于选择新型生物仿生酶
Summary
在这里，我们提出一种方法，以选择大肠杆菌生物蛋白的倍酶BirA的新变种，生物异化特定靶肽。该协议描述了用于靶肽的细菌显示的质粒的构造、BirA库的生成、BirA变体的选择和表征。
Abstract
Biotin 是一种有吸引力的蛋白质转化后修饰，为蛋白质的分离和检测提供了强大的标签。大肠杆菌生物蛋白结合体比抗酶酶具有很强的特异性，允许在其原生环境中对靶蛋白进行生物异化;然而，目前使用BirA介导的生物小化需要在靶蛋白中存在合成接受肽（AP）。因此，其应用仅限于被设计成含有AP的蛋白质。本协议的目的是使用从未修饰的目标蛋白中提取的肽的细菌显示来选择生物仿制肽的BirA变体。该系统基于单个质粒，允许共同表达BirA变异，以及细菌表面肽显示的支架。该协议描述了将目标肽集成到显示支架中、创建 BirA 库、选择活动 BirA 变体和分离的 BirA 变体的初始特征的详细过程。该方法为分离新的BirA变体提供了一个高效的选择系统，可用于生物蛋白蛋白利气的进一步定向进化，在复杂溶液中生物适应原生蛋白。
Introduction
蛋白质的生物素化为它的亲和力分离和检测创造了一个强大的标签。酶蛋白生物异化是一种高度特异性的转化后修饰，由生物锡蛋白气化催化。大肠杆菌生物蛋白联苯比拉是极其特异性的，共价生物酸化仅在特定莱塞残留物1中产生数量有限的自然存在的蛋白质。BirA 催化生物异化的优点目前通过将靶蛋白与小型合成 15-氨基酸生物锡接受肽 （AP） 融合，该肽可有效生物异化2，并允许高度特异性和通过共同表达或添加BirA3，4，5，在体内和体外生物体内建立有效的生物体化。虽然体内和体外BirA催化生物蛋白结扎是一种有吸引力的标签策略，但其应用仅限于含有AP融合蛋白的样品。该方法的目的是开发新的生物蛋白利气突变体，选择性地对原生未改性蛋白质进行生物异化，从而扩大酶生物异化策略的应用范围。
蛋白质功能可以通过基因突变的迭代轮来进化，选择和扩增具有所需功能的基因变异。由于生物锡和链球菌蛋白及其同源性之间的强结合，一个强大而有效的选择策略对于定向进化至关重要，生物蛋白结合酶活性很容易选择。噬菌体显示技术允许选择显示生物仿菌肽7，8的噬菌体。然而，由于分离噬菌体的扩增需要细菌宿主的感染，因此，使用链球菌的噬菌体选择会产生瓶颈，因为生物锡与链球菌的高亲和力结合在非变性下几乎是不可逆的条件。为了确保生物氨酸噬菌体可逆结合，使用亲和力较低的单体性阿胶，从而获得适度的±10倍富集7。我们最近开发了一种细菌显示方法，用于分离新的BirA变体，消除了从亲和基质基质洗脱的需要，从而消除了以前的BirA选择系统9的瓶颈。事实上，我们的细菌显示系统允许在单个选择步骤9中增加1，000，000倍的活性克隆，从而为新型BirA变体的定向进化提供了一个有效的选择系统。
我们的细菌显示系统由两个部分组成，一个带有 C 端 6xHis 标签的 BirA 和一个支持目标肽的表面显示的支架蛋白。我们使用脚手架蛋白增强型循环渗透外膜蛋白X（eCPX），因为肽的有效显示可以在N-和C-termini10，11。目标肽序列与eCPX的C-终点的融合确保了表达活性BirA变异的细菌的生物素化。细菌允许有效的链球菌蛋白选择，因为生物仿当肽现在显示在表面上（图1a）。
这种方法的目的是选择在原生蛋白质中生物肽序列的生物仿菌的BirA的新变种。该系统由存在于质粒pBAD-BirA-eCPX-AP上的基因编码，其中包含控制BirA（阿拉巴德）的阿拉伯诱导启动子和控制eCPX9的T7启动子（图1b）。本协议描述了将来自靶蛋白的肽加入eCPX的C端的详细程序，2）通过容易出错的PCR创建BirA突变库，3）通过选择链球菌结合菌磁活细胞分类（MACS），4）细菌富集的定量，以及5）分离克隆的初始表征。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于所有选择方法，洗涤步骤的严格性至关重要。由于细菌在选定克隆的扩增之前不需要从珠子中洗脱，因此可以使用生物素和链球菌之间的高亲和力结合，而不是像以前使用噬菌体显示系统那样使用较低的亲亲性阿胶，选择比A变型7，8。这确保了稀有的克隆被选择，并且非生物仿菌被丢弃。与噬菌体显示相比，使用细菌显示的另一个优点是细菌显示?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
提交人感谢穆罕默德·阿卜杜拉希·艾哈迈德提供专家技术员援助。这项工作得到了伦德贝克基金会、诺和诺德基金会、丹麦肾脏协会、Aase og Ejnar Danielsen基金会、A.P. Müller 医学科学促进基金会以及克努德和伊迪丝·埃里克森的资助。纪念基金会
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
Referências
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