Bakterielles Peptid-Display zur Auswahl neuartiger Biotinylatierungsenzyme
Summary
Hier stellen wir eine Methode zur Auswahl neuartiger Varianten der E. coli-Biotin-Proteinligase BirA vor, die ein bestimmtes Zielpeptid biotinylatiert. Das Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Plasmids zur bakteriellen Darstellung des Zielpeptids, die Erzeugung einer BirA-Bibliothek, die Auswahl und Charakterisierung von BirA-Varianten.
Abstract
Biotin ist eine attraktive posttranslationale Modifikation von Proteinen, die ein leistungsstarkes Tag für die Isolierung und Detektion von Proteinen bietet. Die enzymatische Biotinylierung durch die E. coli-Biotin-Proteinligase BirA ist sehr spezifisch und ermöglicht die Biotinylierung von Zielproteinen in ihrer heimischen Umgebung; Die aktuelle Verwendung der von BirA vermittelten Biotinylierung erfordert jedoch das Vorhandensein eines synthetischen Akzeptorpeptids (AP) im Zielprotein. Daher ist seine Anwendung auf Proteine beschränkt, die entwickelt wurden, um den AP zu enthalten. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die bakterielle Darstellung eines Peptids aus einem unveränderten Zielprotein zu verwenden, um für BirA-Varianten auszuwählen, die das Peptid biotinylatieren. Das System basiert auf einem einzigen Plasmid, das die Koexpression von BirA-Varianten zusammen mit einem Gerüst für die Peptidanzeige auf der Bakterienoberfläche ermöglicht. Das Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Einbindung des Zielpeptids in das Displaygerüst, die Erstellung der BirA-Bibliothek, die Auswahl aktiver BirA-Varianten und die anfängliche Charakterisierung der isolierten BirA-Varianten. Das Verfahren bietet ein hochwirksames Selektionssystem zur Isolierung neuartiger BirA-Varianten, die für die weitergeleitete Weiterentwicklung von Biotin-Protein-Ligasen verwendet werden können, die ein natives Protein in komplexen Lösungen biotinylaten.
Introduction
Die Biotinylierung eines Proteins erzeugt ein leistungsstarkes Tag für seine Affinitätsisolierung und -detektion. Enzymatische Proteinbiotinylierung ist eine hochspezifische posttranslationale Modifikation, die durch Biotin-Protein-Ligasen katalysiert wird. Die E. coli Biotin-Protein-Ligase BirA ist extrem spezifisch und kovalent biotinylatiert nur eine begrenzte Anzahl natürlich vorkommender Proteine an spezifischen Lysinrückständen1. Die Vorteile der von BirA katalysierten Biotinylierung werden derzeit genutzt, indem das Zielprotein mit einem kleinen synthetischen 15-Aminosäure-Biotin-Akzeptid (AP) verschont wird, das effektiv biotinylatiert2 ist und die hochspezifische und effiziente In-vivo- und In-vitro-Biotinylierung durch Ko-Expression oder Zugabe von BirA3,4,5. Obwohl die in vivo und in vitro BirA katalysierte Biotin-Protein-Ligation eine attraktive Etikettierungsstrategie ist, beschränkt sich ihre Anwendung auf Proben, die AP-verschmolzene Proteine enthalten. Der Zweck dieser Methode ist die Entwicklung neuer Mutanten von Biotin-Protein-Ligasen, die selektiv native unveränderte Proteine biotinylaten und damit die Anzahl der Anwendungen erweitern, in denen die enzymatische Biotinylierungsstrategie eingesetzt werden kann.
Die Proteinfunktion kann durch iterative Runden der Genmutation, Selektion und Amplifikation von Genvarianten mit der gewünschten Funktion entwickelt werden. Eine starke und effiziente Selektionsstrategie ist entscheidend für die gezielte Evolution und die Biotin-Protein-Ligase-Aktivität ist aufgrund der starken Bindung zwischen Biotin und Streptavidin und seinen Homologen6leicht ausgewählt. Phage Display-Technologien ermöglichen die Auswahl von Phagen, die biotinylierte Peptide7,8zeigen. Da die Amplifikation isolierter Phagen eine Infektion eines bakteriellen Wirts erfordert, schafft die Phagenauswahl mit Streptavidin jedoch einen Engpass, da die hochaffine Bindung von Biotin an Streptavidin unter nicht-denaturierender Bedingungen. Um eine reversible Bindung von biotinylierten Phagen zu gewährleisten, wurden monomere Avidine mit geringerer Affinität verwendet, was zu einer bescheidenen Anreicherung von7. Wir haben vor kurzem eine bakterielle Anzeigemethode zur Isolierung neuartiger BirA-Varianten entwickelt, die die Notwendigkeit der Elution aus der Affinitätsmatrix eliminiert und damit einen Engpass aus früheren BirA-Selektionssystemen beseitigt9. Tatsächlich ermöglicht unser bakterielles Anzeigesystem eine >1.000.000-fache Anreicherung aktiver Klone in einem einzigen Selektionsschritt9und bietet so ein effektives Selektionssystem für die gezielte Weiterentwicklung neuartiger BirA-Varianten.
Unser bakterielles Anzeigesystem besteht aus zwei Komponenten, BirA mit einem C-Terminal 6xHis Tag und einem Gerüstprotein, das die Oberflächenanzeige eines Zielpeptids ermöglicht. Wir verwendeten das Gerüstprotein, das kreisförmig permutiertes äußeres Membranprotein X (eCPX) verstärkt hat, da die effektive Anzeige von Peptiden sowohl an den N- als auch an C-termini10,11beobachtet werden kann. Die Verschmelzung der Zielpeptidsequenz zum C-Terminus von eCPX gewährleistet die Biotinylierung von Bakterien, die aktive BirA-Varianten exdrücken. Die Bakterien ermöglichen die effektive Streptavidin-Auswahl, da das biotinylierte Peptid nun auf der Oberfläche angezeigt wird (Abbildung 1a).
Der Zweck dieser Methode ist es, für neuartige Varianten von BirA auszuwählen, die Peptidsequenzen in nativen Proteinen biotinylate. Das System wird durch Gene kodiert, die auf dem Plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP vorhanden sind, das einen arabinose-induzierbaren Promotor enthält, der BirA (araBAD) kontrolliert, und einen T7-Promotor, der eCPX9 kontrolliert (Abbildung 1b). Das vorliegende Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren für die 1) Aufnahme eines Peptids aus einem Zielprotein in das C-Terminal von eCPX, 2) Die Erstellung einer Mutationsbibliothek von BirA durch fehleranfällige PCR, 3) Auswahl von Streptavidin-bindenden Bakterien durch magnetaktivierte Zellsortierung (MACS), 4) Quantifizierung der Bakterienanreicherung und 5) anfängliche Charakterisierung isolierter Klone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie bei allen Selektionsmethoden ist die Strenge der Waschschritte von größter Bedeutung. Da Bakterien vor der Verstärkung der ausgewählten Klone nicht aus den Perlen eluiert werden müssen, kann die hohe Affinitätsbindung zwischen Biotin und Streptavidin anstelle von avidinen mit geringerer Affinität, wie bisher mit dem Phagenanzeigesystem, für die Auswahl der BirA-Varianten7,8. Dadurch wird sichergestellt, dass seltene Klone ausgewählt werden und nicht …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Mohamed Abdullahi Ahmed für die kompetente Technikerhilfe. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Lundbeck-Stiftung, der Novo Nordisk Foundation, der Danish Kidney Association, der Aase og Ejnar Danielsen Foundation, der A.P. M.Ller Foundation for the Advancement of Medical Science sowie Von Knud und Edith Eriksen unterstützt. Memorial Foundation.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
Referências
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