새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이
Summary
여기서 우리는 특정 표적 펩티드를 바이오티게팅하는 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA의 신규한 변이체를 선택하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 표적 펩티드의 세균 디스플레이를 위한 플라스미드의 생성, BirA 라이브러리의 생성, BirA 변이체의 선택 및 특성화에 대해 설명한다.
Abstract
비오틴은 단백질의 분리 및 검출을 위한 강력한 태그를 제공하는 단백질의 매력적인 번역 후 변형입니다. 대장균 바이오틴 단백질 리가제 BirA에 의한 효소 생물학적 인화는 매우 특이적이며 그들의 모국 환경에서 표적 단백질의 생체 이식을 허용합니다. 그러나, 현재 BirA 매개 생물항화의 사용은 표적 단백질에 합성 수용기 펩티드(AP)의 존재를 요구한다. 따라서, 그 적용은 AP를 포함하도록 설계된 단백질로 제한된다. 본 프로토콜의 목적은 수정되지 않은 표적 단백질로부터 유래된 펩타이드의 세균 디스플레이를 사용하여 펩티드를 바이오티엔화하는 BirA 변이체를 선택하는 것입니다. 시스템은 세균 표면에 펩티드 디스플레이를 위한 스캐폴드와 함께 BirA 변이체의 공동 발현을 허용하는 단일 플라스미드를 기반으로 한다. 프로토콜은 디스플레이 스캐폴드 내로 표적 펩티드의 혼입, BirA 라이브러리의 생성, 활성 BirA 변이체의 선택 및 단리된 BirA 변이체의 초기 특성화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 이 방법은 복잡한 용액에서 기본 단백질을 바이오티엔화하는 비오틴 단백질 리가제의 추가 적인 진화에 사용될 수 있는 새로운 BirA 변이체의 분리를 위한 매우 효과적인 선택 시스템을 제공한다.
Introduction
단백질의 생체 화는 친화성 격리 및 검출을위한 강력한 태그를 만듭니다. 효소 단백질 생물항화는 비오틴 단백질 리가제에 의해 촉매작용된 고도로 특이적인 번역 후 변형이다. 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA는 매우 특이적이고 공유성 바이오티니레이트는 특정 리신 잔기에서 자연적으로 발생하는 단백질의 제한된 수에불과합니다 1. BirA 촉매 생물항화의 장점은 현재 표적 단백질을 작은 합성 15-아미노산 비오틴 수용기 펩타이드(AP)와 융합하여 효과적으로 생체티니레이팅2를 허용하고, 고도로 특이적이고 비라3,4,5의공동 발현 또는 첨가에 의한 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생물학적 인 효율적. 생체 내 및 시험관 내 BirA 촉매 비오틴 단백질 결찰은 매력적인 라벨링 전략이지만, 그 적용은 AP 융합 단백질을 포함하는 샘플로 제한된다. 이 방법의 목적은 선택적으로 네이티브 변형되지 않은 단백질을 생물항화하는 비오틴 단백질 리가제의 새로운 돌연변이체의 개발이며, 이에 따라 효소 생물항화 전략이 사용될 수 있는 응용 분야의 수를 확장합니다.
단백질 기능은 원하는 기능을 가진 유전자 변이체의 반복적인 라운드를 통해 진화될 수 있고, 유전자 변이체의 선택, 증폭. 강력하고 효율적인 선택 전략은 비오틴과 스트렙타비딘 및 그 호몰로그(homologs6)사이의 강한 결합으로 인해 지시된 진화 및 비오틴 단백질 리가제 활성이 용이하게 선택되기 위해 매우 중요하다. 파지 디스플레이 기술은 생체 연화 펩티드7,8을표시하는 파지의 선택을 허용한다. 단신 파지의 증폭은 세균 성 숙주의 감염을 필요로하기 때문에, 그러나, streptavidin를 가진 파지 선택은 streptavidin에 비오틴의 높은 친화도 결합이 비 이변의 밑에 사실상 돌이킬 수 없다는 점에서 병목 현상을 만듭니다 조건. 생체 면역 파지의 가역적 결합을 보장하기 위해, 낮은 친화력을 가진 단조로운 아비딘을 사용하였고, 그 결과 ~ 10 배 농축7. 우리는 최근에 선호도 매트릭스로부터 용출의 필요성을 제거하고 이에 따라 이전 BirA 선택 시스템9에서병목 현상을 제거하는 새로운 BirA 변이체의 분리를 위한 세균 표시 방법을 개발하였다. 실제로, 우리의 세균 디스플레이 시스템은 단일 선택 단계9에서활성 클론의 >1,000,000 배 농축을 허용하므로 새로운 BirA 변종의 지시 된 진화를위한 효과적인 선택 시스템을 제공합니다.
우리의 세균 성 디스플레이 시스템은 두 가지 구성 요소로 구성, C 말단 6xHis 태그와 비계 단백질은 대상 펩티드의 표면 표시를 허용. 우리는 펩타이드의 효과적인 디스플레이가 N-및 C-테르미니10,11모두에서 관찰될 수 있기 때문에 스캐폴드 단백질강화된 원형 변막 단백질 X(eCPX)를 사용하였다. 표적 펩타이드 서열을 eCPX의 C-종점과 융합하면 활성 BirA 변이체를 발현하는 박테리아의 생체이식이 보장된다. 박테리아는 생체 연화 된 펩티드가 이제 표면에 표시됨에 따라 효과적인 스트렙타비딘 선택을 허용합니다(도 1a).
이 방법의 목적은 네이티브 단백질에 존재하는 펩티드 서열을 바이오티엔테인화하는 BirA의 새로운 변이체를 선택하는 것입니다. 시스템은 플라스미드 pBAD-BirA-eCPX-AP에 존재하는 유전자에 의해 인코딩되며, 이는 비라(araBAD)를 제어하는 아라비노스 유도 프로모터와 eCPX9를 제어하는 T7 프로모터를 함유한다(도1b). 본 프로토콜은 1) 표적 단백질에서 유래된 펩타이드를 eCPX의 C 말단에 혼입시키는 것에 대한 상세한 절차를 설명하고, 2) 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 의한 BirA의 돌연변이 라이브러리생성, 3) 스트렙타비딘 결합 박테리아의 선택에 의해 자기 활성화 세포 선별 (MACS), 4) 박테리아 농축의 정량화 및 5) 분리 된 클론의 초기 특성.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 선택 방법에 관해서는, 세척 단계의 엄격성이 가장 중요합니다. 박테리아는 선택된 클론의 증폭 전에 구슬에서 용출될 필요가 없기 때문에, 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 높은 친화도 결합은 이전에 파지 디스플레이 시스템과 마찬가지로 낮은 친화도 아비딘을 사용하는 대신 사용될 수 있습니다. BirA 변종7,8의선택 . 이것은 희귀 한 클론이 선택?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 전문 기술자 지원에 대한 모하메드 압둘라흐리 아메드 감사. 이 작품은 룬드벡 재단, 노보 노디스크 재단, 덴마크 신장 협회, 아세 og Ejnar 다니엘센 재단, 의학 발전을위한 A.P. Møller 재단, 그리고 크누드와 에디스 에릭센의 보조금에 의해 지원되었다 기념 재단.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
Referências
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme’s Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
