Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Summary

Virkningerne af migrastatiske hæmmere på gliom cancer celle migration i tredimensionelle (3D) invasion assays ved hjælp af en Histon deacetylase (HDAC) hæmmer er karakteriseret ved høj opløsning Konfokal mikroskopi.

Abstract

Drug opdagelse og udvikling i kræftforskning er i stigende grad baseret på narkotika skærme i et 3D-format. Nye hæmmere, der er rettet mod kræftcellernes migrerende og invasive potentiale, og dermed den metastatiske sygdomsspredning, opdages og betragtes som supplerende behandlinger i stærkt invasive kræftformer såsom gliomer. Således er det nødvendigt at generere data, der muliggør detaljerede analyser af celler i et 3D-miljø efter tilsætning af et lægemiddel. Den beskrevne metode, der kombinerer sfæroide invasion assays med høj opløsning billedoptagelse og dataanalyse af confokal Laserscanning mikroskopi (clsm), aktiveret detaljeret karakterisering af virkningerne af den potentielle anti-migrerende hæmmer MI-192 på gliom-celler. Sfæroider blev genereret fra cellelinjer til invasion assays i lav overholder 96-brønd plader og derefter forberedt til CLSM analyse. Den beskrevne arbejdsgang blev foretrukket frem for andre almindeligt anvendte sfæoidskabende teknikker på grund af både lethed og reproducerbarhed. Dette, kombineret med den forbedrede billedopløsning opnået ved Konfokal mikroskopi sammenlignet med konventionelle bred-felt tilgange, tillod identifikation og analyse af særskilte morfologiske ændringer i migrerende celler i et 3D-miljø efter behandling med det migræstatiske lægemiddel MI-192.

Introduction

Tredimensionelle sfæriske teknologier til prækliniske lægemidler opdagelse og udvikling af potentielle kræftlægemidler er i stigende grad favoriseret over konventionelle stof skærme; således er der mere udvikling af migrastatic-migration og invasion forebyggelse-narkotika. Begrundelsen for denne udvikling i kræftbehandling er klar: 3D sfæroide assays repræsenterer en mere realistisk tilgang til screening potentielle anti-cancer stoffer, som de efterligner 3D tumor arkitektur mere trofast end celle enkeltlags kulturer, rekapitulere Drug-tumor interaktioner (kinetik) mere præcist, og tillade karakterisering af narkotika aktivitet i en tumor-relaterede indstilling. Hertil kommer, at stigningen i resistens over for kemo toksiske lægemidler i mange kræfttyper og høje dødelighed blandt kræftpatienter på grund af metastase potenseret af kræftcellernes evne til at migrere til fjerne tumor sites understøtter optagelsen af kemoterapeutika målretning af kræftcellernes migrations potentiale som adjuverende behandling i fremtidige kliniske kræft forsøg¹. Dette er især tilfældet i forbindelse med stærkt invasive kræftformer, såsom glioblastomi af høj kvalitet (GBM). GBM Management omfatter kirurgi, strålebehandling, og kemoterapi. Men selv med kombinationsbehandling, de fleste patienter tilbagefald inden for 1 år efter Initial diagnose med en Median overlevelse på 11-15 måneder^2,3. Store fremskridt inden for 3D-teknologi er blevet gjort i løbet af de sidste par år: roterende systemer, mikrofabrikerede strukturer og 3D stilladser, og andre individuelle assays løbende forbedres for at muliggøre rutinetest på en stor skala^{4, 5,6,7}. Resultaterne fra disse analyser skal dog analyseres på en meningsfuld måde, fordi data fortolkningen ofte hindres af forsøg på at analysere 3D-genererede data med 2D-billedanalyse systemer.

På trods af at være at foretrække med hensyn til billed erhvervelse hastighed og reduceret foto-toksicitet, de fleste Wide-felt systemer forbliver begrænset af resolution⁸. Således, bortset fra data læse-outs vedrørende Drug effekt, detaljerede virkninger af narkotika handling på 3D cellulære strukturer af migrerende celler er uundgåeligt tabt, hvis afbildet ved hjælp af et bredt felt system. Omvendt, confokal Laserscanning mikroskopi (CLSM) fanger høj kvalitet, optisk sektionerede billeder, der kan rekonstrueres og gengives i 3D efter erhvervelse ved hjælp af edb-software. Således, CLSM er let anvendelig på billeddannelse komplekse 3D cellulære strukturer, hvilket muliggør afhøring af virkningerne af anti-migrastatiske hæmmere på 3D-strukturer og dybtgående analyser af celle migration mekanismer. Dette vil utvivlsomt guide fremtidige migrastatisk narkotika udvikling. Her beskrives en kombineret arbejdsgang for sfætoid generering, narkotikabehandling, farvnings protokol og karakterisering af højopløsnings Konfokal mikroskopi.

Protocol

1. generering af celle Sfæroider Dag 1 Forbered standard dyrkningsmediet som krævet af den cellelinje, der undersøges. Udfør alle vævskultur-relaterede trin i en vævskultur hætte ved hjælp af sterile håndteringsteknikker. Trypsinize og tælle kræftceller. Brug 20 mL cellesuspension pr. plade. Opbevar celle suspensionerne i tydeligt mærkede sterile Universal rør. Tilføj et forudbestemt antal celler til hver brønd. Både det …

Representative Results

Tredimensionel sfærisk teknologi fremmer forståelsen af lægemiddel tumor interaktioner, fordi det er mere repræsentativt for det kræftspecifikke miljø. Dannelse af sfæroider kan opnås på flere måder; lav vedhæftning 96-brønd plader blev brugt i denne protokol. Efter at have testet flere produkter fra forskellige producenter, blev pladerne, der blev brugt her, valgt, fordi de konsekvent klarede sig bedst i form af en vellykket sfæroide-produktion og ensartethed. Udskiftnings t…

Discussion

En ny måde at oprette kræft celle sfæroider til identifikation af migræt stof aktivitet ved hjælp af høj opløsning Konfokal mikroskopi er beskrevet. Brugen af lave vedhængende plader over andre teknikker, såsom hængende Drops¹⁵, har lettet et middel til at generere reproducerbare og ensartede sfæroider til brug i kollagen migration og invasion assays. De kritiske punkter i denne protokol er fjernelsen af vækstmediet fra 96-brønd pladen forud for celle sfæroide-indlejringen i en kolla…

Materials

Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3ml)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.