Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Summary

Effekten av migrastatic hemmere på glioma kreftcelle migrasjon i tredimensjonale (3D) invasjon analyser ved hjelp av en Histone deacetylase (HDCA) inhibitor er preget av høyoppløselig konfokalmikroskopi mikroskopi.

Abstract

Drug oppdagelse og utvikling i kreftforskning er i økende grad basert på narkotika skjermer i et 3D-format. Romanen hemmere rettet mot trekk og invasiv potensialet for kreftceller, og følgelig metastatisk spredning av sykdom, blir oppdaget og betraktes som komplementære behandlinger i svært invasiv kreftformer som gliomas. Dermed er det nødvendig å generere data som muliggjør detaljert analyse av celler i et 3D-miljø etter tilsetning av et medikament. Metodikken beskrevet her, kombinerer spheroid invasjon analyser med høyoppløselig bilde fangst og dataanalyse av konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi (CLSM), aktivert detaljert karakterisering av virkningene av den potensielle anti-trekk-hemmer MI-192 på glioma celler. Spheroids ble generert fra cellelinjer for invasjon analyser i lav tilhenger 96-brønn plater og deretter forberedt for CLSM analyse. Den beskrevne arbeidsflyten ble foretrukket fremfor andre brukte spheroid teknikker på grunn av både enkel og reproduserbarhet. Dette, kombinert med forbedret bildeoppløsning oppnådd ved konfokalmikroskopi mikroskopi sammenlignet med konvensjonelle bredt felt tilnærminger, tillot identifisering og analyse av distinkte morfologiske endringer i trekk celler i et 3D-miljø etter behandling med migrastatic stoffet MI-192.

Introduction

Tredimensjonale spheroid teknologier for prekliniske narkotika oppdagelse og utvikling av potensielle kreft stoffer blir i økende grad favorisert over konvensjonelle narkotika skjermer; Dermed er det mer utvikling av migrastatic-migrasjon og invasjon forebygge-narkotika. Begrunnelsen bak denne utviklingen i kreft behandling er klar: 3D spheroid analyser representerer en mer realistisk tilnærming for screening potensielle anti-kreft narkotika som de etterligner 3D svulst arkitektur mer trofast enn celle monolag kulturer, recapitulate legemiddel-tumor interaksjoner (Kinetics) mer nøyaktig, og tillate karakterisering av narkotika aktivitet i en svulst-relaterte innstillingen. I tillegg, fremveksten av resistens mot chemotoxic narkotika i mange krefttyper og høy dødelighet blant kreftpasienter på grunn av metastasering forsterket av evnen til kreftceller til å migrere til fjerne tumor nettsteder støtter inkludering av kjemoterapeutiske agenter målretting av trekk potensialet av kreftceller som adjuvant behandling i fremtidig klinisk kreft forsøk¹. Dette er spesielt tilfelle i svært invasiv kreft, for eksempel høyverdig glioblastomas (GBM). GBM ledelse omfatter kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi. Men selv med Kombinasjonsbehandling, de fleste pasientene tilbakefall innen 1 år etter første diagnose med en median overlevelse av 11-15 måneder^2,3. Store fremskritt innen 3D-teknologi har blitt gjort de siste årene: roterende systemer, microfabricated strukturer og 3D-stillaser, og andre individuelle analyser blir kontinuerlig forbedret for å tillate rutinemessig testing på en stor skala^{4, 5,6,7}. Resultatene fra disse analysene må imidlertid analyseres på en meningsfull måte fordi data tolkning ofte hindres av forsøk på å analysere 3D-genererte data med 2D-bildeanalyse systemer.

Til tross for å foretrekke i form av bildet oppkjøpet hastighet og redusert Foto-toksisitet, de fleste Wide-feltet systemer fortsatt begrenset av oppløsning⁸. Således, bortsett fra data lese-outs knyttet til narkotika effekt, detaljerte effekter av narkotika handling på 3D cellulære strukturer av migrere celler er uunngåelig tapt hvis avbildet ved hjelp av et bredt felt system. Omvendt, konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi (CLSM) fange høy kvalitet, optisk delt profilen det kan rekonstruert og gjengitt inne 3D stolpe-oppkjøpet benytter computer programvare. Således, CLSM er lett anvendelig å tenkelig innviklet 3D Cellular strukturer, derved muliggjør avhør av effektene av anti-migrastatic hemmere opp på 3D strukturer og inne-dybden analyser av cellen Migration mekanismer. Dette vil utvilsomt veilede fremtidige migrastatic narkotika utvikling. Her beskrives en kombinert arbeidsflyt av spheroid generasjon, legemiddelbehandling, fargeprotokoll og karakterisering av konfokalmikroskopi mikroskopi med høy oppløsning.

Protocol

1. generering av Cell Spheroids Dag 1 Klargjør standard kultur medium slik det kreves av cellelinjen under etterforskning. Utføre alle vev kultur-tilknyttede trinn i en vev kultur hette ved hjelp av sterile håndtering teknikker. Trypsinize og telle kreftceller. Bruk 20 mL celle oppheng per plate. Hold celle suspensjoner i tydelig merket sterile Universalrør. Legg til et forhåndsbestemt antall celler i hver brønn. Både det første …

Representative Results

Tredimensjonal spheroid teknologi er fremme forståelsen av narkotika-tumor interaksjoner fordi det er mer representativt for kreft-spesifikke miljø. Generering av spheroids kan oppnås på flere måter; lav tilslutning 96-brønn platene ble brukt i denne protokollen. Etter testing flere produkter fra ulike produsenter, platene som brukes her ble valgt fordi de konsekvent utført best i forhold til vellykket spheroid produksjon og ensartethet. Utskifting trinn, der veksten medium er erst…

Discussion

En ny måte å skape kreftcelle spheroids for identifisering av migrastatic narkotika aktivitet ved hjelp av høyoppløselig konfokalmikroskopi mikroskopi er beskrevet. Bruken av lave tilhenger plater over andre teknikker, slik som hengende dråper¹⁵, har muliggjort et middel til å generere reproduserbar og ensartet spheroids for bruk i kollagen migrasjon og invasjon analyser. Den kritiske punkter i denne protokollen er fjerning av vekstmedium fra 96-brønn plate før celle spheroid innebygging i…

Materials

Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3ml)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.