Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Summary

Os efeitos de inibidores migrastatic na migração da pilha do cancro do glioma em ensaios tridimensionais da invasão (3D) usando um inibidor do do histone do histona (HDAC) são caracterizados pela microscopia confocal de alta resolução.

Abstract

Descoberta de drogas e desenvolvimento em pesquisa de câncer está sendo cada vez mais baseado em telas de drogas em um formato 3D. Os inibidores novos que visam o potencial migratório e invasor de pilhas de cancro, e conseqüentemente a propagação metastática da doença, estão sendo descobertos e considerados como tratamentos complementares em cancros altamente invasores tais como gliomas. Assim, é necessário gerar dados que permitam a análise detalhada das células em um ambiente 3D após a adição de uma droga. A metodologia descrita aqui, combinando ensaios de invasão esferóide com captura de imagem de alta resolução e análise de dados por microscopia de varredura por laser confocal (CLSM), permitiu a caracterização detalhada dos efeitos do potencial inibidor antimigratório MI-192 em células de glioma. Os spheroids foram gerados das linhas de pilha para ensaios da invasão em placas 96-well aderentes baixas e preparadas então para a análise de CLSM. O fluxo de trabalho descrito foi preferível em relação a outras técnicas geradoras de spheroóides comumente usadas, devido à facilidade e reprodutibilidade. Isto, combinado com a definição aumentada da imagem alcançada pela microscopia confocal comparada às aproximações convencionais do largo-campo, permitiu a identificação e a análise de mudanças morfológicas distintas em pilhas migratórias em um ambiente 3D que segue tratamento com a droga migrastatic MI-192.

Introduction

As tecnologias esferóide tridimensionais para a descoberta pré-clínica da droga e o desenvolvimento de drogas cancerosas potenciais estão sendo favorecidas cada vez mais sobre telas convencionais da droga; assim, há mais desenvolvimento de migração migrastatic-e prevenção de invasão-drogas. A lógica subjacente a esses desenvolvimentos no tratamento do câncer são claras: ensaios de esferóide 3D representam uma abordagem mais realista para a triagem de drogas anti-câncer potenciais como eles imitam a arquitetura do tumor 3D mais fielmente do que as culturas monocamada celular, recapitular interações do droga-tumor (cinética) mais exatamente, e permita a caracterização d....

Protocol

1. geração de spheroids da pilha

Dia 1

1. Prepare o meio de cultura padrão conforme exigido pela linha de célula investigação.
2. Realize todas as etapas associadas à cultura tecidual em uma capa de cultura tecidual usando técnicas de manuseio estéril.
3. Trypsinize e contagem de células cancerosas. Use 20 mL de suspensão celular por placa. Mantenha as suspensões da pilha em tubos universais estéreis claramente etiquetados.
4. Adicione um número predeterminado de células a cada poço. Tanto o número inicial de células quanto o tamanho de esferóide final exigido dependem da taxa de proliferação da ....

Results

A tecnologia de esferóide tridimensional está avançando a compreensão de interações do droga-tumor porque é mais representativa do ambiente cancro-específico. A geração de esferóides pode ser alcançada de várias maneiras; as placas da baixa aderência 96-well foram usadas neste protocolo. Depois de testar vários produtos de diferentes fabricantes, as placas usadas aqui foram escolhidos porque eles consistentemente realizada melhor em termos de produção de esferóide bem sucedida e uniformid.......

Discussion

Uma maneira nova de criar esferoides da pilha de cancro para a identificação da atividade migrastatic da droga usando a microscopia confocal de alta resolução é descrita. O uso de placas aderentes baixas sobre outras técnicas, como gotas suspensas¹⁵, facilitou um meio de gerar esferóides reprodutíveis e uniformes para uso nos ensaios de migração e invasão de colágeno. Os pontos críticos neste protocolo são a remoção do meio de crescimento da placa 96-well antes do esferóide da pilha que encaixa em.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colágeno I, cauda de rato, 100 mg	Corning	354236	para ensaio de invasão de glioma; isso é oferecido por muitos distribuidores / fabricantes e precisará ser determinado para o tipo de ensaio pretendido e as linhas celulares usadas. Para linhagens de células de câncer de glioma, o colágeno de cauda de rato tipo 1 (por exemplo, Corning) é a escolha preferida. O colágeno deve ser armazenado a 4 & C, no escuro, até que seja necessário. Não é aconselhável misturar colágeno de diferentes lotes, pois isso pode afetar a consistência do colágeno polimerizado.
Lamínulas	várias		para imagens de microscopia
DMEM em pó	Sigma	D5648	necessário na concentração de 5x para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma;   Este pode ser adquirido em pó, feito em água bidestilada e, dependendo da composição final do meio de cultura, completado com quaisquer aditivos necessários. A solução 5x completa deve ser filtrada através de um sistema de filtro de seringa (0,22 μ m) antes do uso.
Soro fetal de bezerro	Sigma	F7524-500ML	necessário para cultura celular de linhas celulares de glioma
Lâminas de vidro	vários	vários	para imagens microscópicas
Alta glicose DMEM	Gibco	41965062	necessário para cultura celular de linhas celulares de glioma
Inibidor	Tocris	vários	vários - de acordo com o projeto experimental; os inibidores podem ser adquiridos de fabricantes como Selleckchem e Tocris. Esses fabricantes oferecem descrição detalhada das características do inibidor, links para referências associadas e sugestão de concentrações de trabalho. Tal como acontece com todos os inibidores, eles podem ser potencialmente tóxicos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes de saúde e segurança. Os inibidores são preparados como soluções de estoque, conforme recomendado pelo fabricante. Como exemplo, usamos o inibidor de enxaqueca MI-192 para demonstrar o uso de tais inibidores. Testamos uma variedade de inibidores da enxaqueca dessa maneira com resultados comparáveis.
Montagem	de vários		para imagens microscópicas
NaOH (1 M)	vários	vários	NaOH podem ser adquiridos na molaridade necessária ou preparados a partir da forma sólida. A solução preparada deve ser esterilizada por filtro usando um sistema de filtro de seringa. One M NaOH é corrosivo e deve-se tomar cuidado durante a preparação da solução.
Paraformaldeído	vários	vários	para fixar esferoides e células; maquiagem a 4%, cuidado com o risco à saúde, garantir que os regulamentos de saúde e segurança sejam cumpridos para a solução de colágeno para ensaio
de invasão Pastettes (pipeta graduada, 3 mL)	vários	vários para	ensaio de invasão, remoção de solução
PBS, estéril para cultura de tecidos	Sigma	D1408-500ML	necessário para cultura celular de linhagens celulares de glioma e lavagens para coloração
Pen/estreptococos (antibióticos)	Sigma	P4333	necessário para a cultura celular de linhas celulares de glioma
Anticorpo primário, anticorpo secundário, DAPI, Faloidina	vários	vários existem	muitos fabricantes para esses reagentes, para anticorpos marcados secundários, recomendamos Alexa Fluor (Sondas Moleculares). Aqui usamos para anticorpos primários anticorpo de tubulina anti-acetilada de camundongo (1/100, Abcam). Para anticorpos secundários, usamos 1/500 anticorpo conjugado Alexa Fluor 488 anti-camundongo, Sondas Moleculares. Para a coloração nuclear, usamos DAPI (muitos fabricantes) e a coloração de actina Faloidina (muitos fabricantes), ambos usados na diluição recomendada de 1/500.
Bicarbonato de sódio	Sigma	S5761	necessário para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma na concentração de 5x
Piruvato de sódio	Sigma	P5280	necessário para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma na concentração de 5x
Tripsina	Sigma	T4049	para tripsinização
Placas de fixação ultra baixa	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	para ensaio de invasão de glioma; É necessária uma placa de baixa aderência, com placas de 96 poços preferidas para permitir a triagem em larga escala dos compostos sob investigação. Existem várias placas de baixa aderência disponíveis comercialmente; É aconselhável testar uma variedade de placas para uma geração ideal de esferóides. Em nossa experiência, o Costar Ultra Low Cluster com tampa, fundo redondo, funciona melhor para a geração de esferóides a partir de células cancerígenas de glioma em termos de 100% de formação e reprodutibilidade de esferóides. Essas placas também foram usadas com sucesso para a geração de esferóides de glioma a partir de material derivado de pacientes, células de câncer de bexiga e ovário em nosso laboratório. Além disso, neuroesferas de caule ou progenitoras podem ser usadas nessas placas para facilitar a geração de esferoides de neuroesferas padronizados
Stripettes (pipetas sorológicas, estéreis, 5 mL e 10 mL)	vários, por exemplo, Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	para cultura de tecidos e preparação de colágeno
Vários multicanais (50 - 250 μ L) e pipetas monocanal (10 μ L, 50 μ L, 200 μ L 1 mL)	vários	vários	para manuseio de células e esferoides
Microscopia de campo amplo	vários	várias	para observação da geração de esferóides e imagens de esferóides; aqui imagens de fluorescência de campo amplo foram capturadas usando um sistema de imagem de células EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipado com uma objetiva de óleo Plan Apochromat 63x 1.4 NA	Zeiss	do fabricante	As imagens confocais foram capturadas usando uma objetiva de óleo Zeiss LSM 880 CLSM equipada com uma objetiva de óleo Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Lasers de diodo 405nm, 458/488/514nm argônio multilinha e HeNe 594nm foram usados para excitar Faloidina 594, Alexa Fluor 488 e DAPI, respectivamente. Para cada imagem, uma única seção óptica representativa foi capturada, com todas as configurações, pré e pós-captura de imagem, mantidas para fins comparativos. Todas as imagens foram posteriormente processadas usando o software de imagem Zen associado e o Adobe Photoshop.