Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A barreira hematola (BBB) é uma defesa importante contra a entrada de agentes potencialmente tóxicos ou patogênicos do sangue para o sistema nervoso central (SNC). No entanto, sua existência também reduz drasticamente a acessibilidade dos agentes terapêuticos administrados sistemicamente ao SNC. Um método para superar isso, é injetar esses agentes diretamente no líquido cefalorraquidiano (CSF), ignorando assim o BBB. Isso pode ser feito através da implantação de um cateter para infusão contínua usando uma bomba osmótica, ou para entrega única bolus. Neste artigo, descrevemos um protocolo cirúrgico para a entrega de oligonucleotídeos antisenso (ASOs) através de um cateter implantado diretamente no espaço cauda equina da coluna de ratos adulta. Como resultados representativos, mostramos a eficácia de uma única injeção intrathecal (TI) de ASO através deste sistema de cateterismo em derrubar o RNA alvo em diferentes regiões do CNS de ratos. O procedimento é seguro, eficaz e não requer equipamentos caros ou ferramentas cirúrgicas. A técnica descrita aqui pode ser adaptada para entregar drogas em outras modalidades também.
Introdução
O sistema vascular do sistema nervoso central (SNC) evoluiu como um regulador crítico da homeostase, controlando o tráfego de moléculas, fornecendo nutrientes e livrando-se do desperdício. Este sistema é também a primeira linha de defesa de ataques de patógenos externos, graças a uma densa distribuição de junções apertadas ao longo das paredes das células endotélias. Estas junções apertadas compõem um aspecto da barreira cerebral do sangue (BBB). Enquanto o BBB permite o transporte de moléculas necessárias para atender demandas de nutrientes e energia (por exemplo, íons, glicose), também limita seletivamente a passagem de patógenos, bem como produtos químicos tóxicos<....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos in vivo foram realizados no âmbito do Biogen Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) protocolos aprovados que seguem as diretrizes estabelecidas pelo Guia dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Preparação de materiais e instrumentos
- Prepare as cânulas guia especial.
- Use uma ferramenta rotativa com roda de corte (ou uma serra afiada) para cortar as duas extremidades de uma agulha de 19 G, resultando em uma cânula guia de ~ 1,5-2 cm de comprimento (Figura 1Aiii). Use a roda de moa....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Usando o método descrito aqui, injetamos dois grupos de ratos fêmeas adultos (250-300 g; n = 10/group) com um único bolus de PBS salina tampão de fosfato ou 300 μg de ASO visando o longo não codificação (linc) RNA Malat1; em nosso laboratório, usamos rotineiramente o Malat1 ASO como um composto de ferramenta, porque Malat1 é expressa onipresente e em altos níveis em todos os tecidos14, incluindo cérebro e medula espinhal. O Malat1 ASO funciona através de um mecanis.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O artigo atual mostra um método poderoso para entregar agentes terapêuticos diretamente no CNS do rato. Em teoria, uma técnica semelhante também pode ser realizada em camundongos, embora devido ao tamanho menor, o método pode ser mais desafiador. Portanto, nosso grupo realiza injeções intracerebroventriculares (ICV) em camundongos para entrega de medicamentos do SNC, que atingem os mesmos objetivos por meio de uma rota de administração diferente. Esse método foi descrito em outro estudo16.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores são todos funcionários da Biogen, Inc. ou Ionis Pharmaceuticals. Os autores recebem os oligonucleotídeos antisenso descritos no artigo da Ionis Pharmaceuticals.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à Ionis Pharmaceuticals por fornecer os ASOs descritos no artigo.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Campo Pequeno para Cortina Steri-Drape 3M com Abertura Adesiva | 3M | 1020 | |
| 70% etanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | |
| Bastões de cotonete com álcool | Dynarex | NO 1204 | |
| BD Seringas de Uso Geral 1 mL Ponta Luer-Lok | BD | 1ml TB Ponta Luer-Lok | BD 302830 |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Tubulação de polietileno BD PE50 Diâmetro 0,023 in | BD 427400 (10 pés, Fischer Scientific 22-204008) ou 427401 (100 pés, Fischer Scientific 14-170-12P) |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Tubulação de polietileno PE10 Diâmetro 0,011 in | BD 427410 (10 pés, Fischer Scientific 14-170-11B) ou 4274011 (100 pés, Fischer Scientific 14-170-12B) |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 ou Fisher Scientific 14-826-19E |
| BD PrecisionGlide Agulhas de uso único 30G | BD | BD | |
| Buprenorfina Liberação Sustentada - laboratório | ZooPharm | Prescrição necessária | |
| Esterilizador de óxido de etileno | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, esterilizador a gás | AN 74i |
| Cânula guia | BD | 19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) agulha | BD 305186 |
| Seringa Hamilton 100ul | Empresa Hamilton | Seringa Hamilton 100ul | |
| Esterilizador de esferas quentes | ciências | finas ESTERILIZADOR MODELNO FST 250 | |
| Pomada oftálmica | Produto veterinário Dechra | 17033-211-38 | |
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | |
| Esfoliante de povidona | PDI | S48050 | |
| Solução salina | Baxter | Cloreto de sódio 0,9% Infusão intravenosa BP 50ml | FE1306G |
| bisturi | descartável de penas | No. 10 | |
| Almofada de aquecimento para pequenos animais | K & H Manufacturing | Modelo # 1060 | |
| Estilete de Fio | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 |
| toalha | Dynarex | 4410 | |
| Tesoura cirúrgica e fórceps | FST e Suturas Fisher Scientific | ||
| Ethicon | 4-0 ou 5-0 | ||
| Ferramenta para fazer o canular guia | Ferramenta rotativa Grainger | (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) |
| Disco de corte de bloqueio EZ | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | ||
| Rebolo, Óxido de Alumínio | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | ||
| Mandril de bloqueio EZ | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | ||
| Piso de roda diamantada Azulejo | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | ||
| Fonte alternativa de materiais pré-fabricados e esterilizados para este procedimentoSistema de | |||
| infusão | RIDC-01 | ||
| infusão SAI | RIDC-GCA | ||
| Cateteres internos | infusão SAI | RIDC-INC Sistemas de | |
| SAI de fio estilete | CEPID-STY |
Referências
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Greene, C., Campbell, M. Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS deliv....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
