Intratekal tillförsel av antisense Oligonukleotides i råtta centralanervsystemet
Summary
Här beskriver vi en metod för att leverera läkemedel till råtta centralanervsystemet genom att implantera en kateter i ländryggen intratekala utrymmet i ryggraden. Vi fokuserar på leverans av antisense oligonukleotides, även om denna metod är lämplig för leverans av andra terapeutiska modaliteter också.
Abstract
Blod-hjärnbarriären (BBB) är ett viktigt försvar mot ingången av potentiellt giftiga eller patogena agenter från blodet in i centralanervsystemet (CNS). Emellertid, dess existens också dramatiskt sänker tillgängligheten av systemiskt administrerade terapeutiska medel till CNS. En metod för att övervinna detta, är att injicera dessa agenter direkt i cerebrospinalvätskan (CSF), vilket kringgår BBB. Detta kan göras via implantation av en kateter för antingen kontinuerlig infusion med hjälp av en osmotisk pump, eller för enkel bolusleverans. I denna artikel beskriver vi ett kirurgiskt protokoll för leverans av CNS-riktade antisense oligonukleotides (ASOs) via en kateter implanteras direkt i cauda equina utrymme för vuxna råtta ryggraden. Som representativa resultat, visar vi effekten av en enda bolus ASO intratekal (IT) injektion via detta kateterization system i knackar ner målet RNA i olika regioner i råtta CNS. Förfarandet är säkert, effektivt och kräver inte dyr utrustning eller kirurgiska verktyg. Tekniken som beskrivs här kan anpassas för att leverera läkemedel även i andra modaliteter.
Introduction
Det vaskulära systemet i centralanervsystemet (CNS) har utvecklats som en kritisk regulator av homeostas, styra trafiken av molekyler, levererar näringsämnen och bli av med avfall. Detta system är också den första försvarslinjen från angrepp av externa patogener, tack vare en tät fördelning av snäva korsningar längs väggarna i endotelceller. Dessa snäva korsningar utgör en aspekt av blod-hjärnbarriären (BBB). Medan BBB tillåter transport av molekyler som krävs för att uppfylla näringsämnen och energikrav (t. ex., joner, glukos), det också selektivt begränsar passage av patogener samt giftiga kemikalier1,2,3.
Ironiskt nog, samma skyddande funktion av BBB som begränsar passage av patogener och giftiga kemikalier också är det största hindret för vår förmåga att enkelt komma åt CNS med terapeutiska behandlingar efter systemisk administrering till organismen2, 4,5. Denna roll av BBB har föranlett utvecklingen av en uppsjö av nya läkemedelsdistribution teknik och metoder6.
Ett sätt att övervinna detta hinder är att injicera läkemedlen direkt i cerebrospinalvätskan (CSF) som kontinuerligt perfuses både hjärnan och ryggmärgen7,8,9,10. I den här artikeln beskriver vi en metod för att framgångsrikt leverera agenter i ländryggen intratekalt utrymme genom att placera den inre änden av katetern helt i cauda equina utrymme av råtta ryggraden. En beskrivning av detta förfarande har tidigare publicerats av Mazur et al. på andra håll11.
Protokollet är mycket effektivt och ger en större än 90% framgång av antisense oligonukleotide (ASO) leverans till CNS vid bedömning av kvantitativ polymeras kedjereaktion (qPCR) analys av mål genen knockdown8. Förfarandet orsakar minimalt obehag för djuren, som 100% av råttorna överlever operationen och visar minimal svullnad runt det kirurgiska såret och inga tecken på ångest (t. ex., hyperaktivitet, uttorkning, cirkling, förlust av balans, minskat födointag, och dehydrering) vid post-op observation. En annan fördel med den metod som beskrivs här är att det inte kräver dyr utrustning, eller några speciella verktyg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuvarande artikeln visar en kraftfull metod för att leverera terapeutiska medel direkt i råtta CNS. I teorin kan en liknande teknik också utföras på möss, men på grund av den mindre storleken, kan metoden vara mer utmanande. Därför, vår grupp utför intracerebroventrikulär (ICV) injektioner i möss för CNS Drug leverans, som når samma mål genom en annan administreringsväg. Den metoden har beskrivits i en annan studie16.
Fördelen med den metod som bes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi skulle vilja tacka Ionis Pharmaceuticals för att leverera ASOs beskrivs i artikeln.
Materials
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | ||
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | ||
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | ||
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) | |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E | 120V 1.2A |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | ||
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | ||
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i | |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 | |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | ||
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | ||
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | ||
| Povidone scrub | PDI | S48050 | ||
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G | |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 | |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | ||
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 | |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | ||
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | |||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | ||
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) | 1.5” diameter, Pk5 |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | 1.5”, Pk2 | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | |||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | 1.5” diameter | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | |||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | ||||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | ||
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | ||
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | ||
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
Referências
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Greene, C., Campbell, M. Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules. Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).
- Daneman, R., Engelhardt, B. Brain barriers in health and disease. Neurobiology of Disease. 107 1-3 (2017).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).
- Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. Recent advances in delivery through the blood-brain barrier. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).
- Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. A new look at cerebrospinal fluid circulation. Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).
- Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor. Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).
- Wahlestedt, C. et al. Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions. Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).
- Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides. Science. 259 (5094), 528-531 (1993).
- Mazur, C. et al. Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).
- Wolf, D. A. et al. Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).
- Becker, L. A. et al. Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice. Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).
- Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions. RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).
- Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- McCampbell, A. et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).
- Schoch, K. M., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases. Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).
- Lane, R. M. et al. Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease. Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Antisense oligonucleotides in neurological disorders. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, 1756286418776932 (2018).
- Haché, M. et al. Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience. Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).
- Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy. Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Nusinersen for spinal muscular atrophy. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, 1756285618754459 (2018).
