Высокая пропускная мощность Ко-культуры Анализы для исследования микробных взаимодействий
Summary
Анализы взаимодействия сокультуры, представленные в этом протоколе, являются недорогими, высокой пропускной их частью и простыми. Эти анализы могут быть использованы для наблюдения микробных взаимодействий в совместной культуре, выявления моделей взаимодействия и характеристики ингибирующего потенциала микробного штамма, интересующегося человеческими и экологическими патогенами.
Abstract
Изучение взаимодействий между микроорганизмами привело к многочисленным открытиям, от новых противомикробных препаратов до понимания микробной экологии. Многие подходы, используемые для изучения микробных взаимодействий, требуют специального оборудования и являются дорогостоящими и трудоемкими. В настоящем документе представлен протокол для анализов взаимодействия совместной культуры, которые являются недорогими, масштабируемыми для больших выборочных номеров и легко адаптируемыми к многочисленным экспериментальным проектам. Микроорганизмы культивируются вместе, каждый из которых хорошо представляет одну парную комбинацию микроорганизмов. Испытательный организм культивируется на одной стороне каждого колодца и впервые инкубируется в монокультуре. Впоследствии организмы-мишени одновременно прививаются на противоположную сторону каждого колодца с помощью 3D-печатной прививочной марки. После совместной культуры, завершенные анализы забиваются для визуальных фенотипов, таких как рост или ингибирование. Эти анализы могут быть использованы для подтверждения фенотипов или выявления закономерностей среди изолятов интересов. Используя этот простой и эффективный метод, пользователи могут анализировать комбинации микроорганизмов быстро и эффективно. Этот подход к совместной культуре применим к открытию антибиотиков, а также к исследованиям в области микробиома на основе культуры и уже успешно применяется в обоих приложениях.
Introduction
В природе микроорганизмы редко существуют в изоляции; следовательно, они постоянно взаимодействуют с другими организмами. Поэтому изучение того, как микроорганизмы взаимодействуют друг с другом, имеет важное значение для понимания множества микробных поведений1. Микробные взаимодействия могут быть взаимоиссосимыми, сопутствующими или антагонистическими. Эти в teractions может повлиять не только на сами химеры микроорганизмов, но и окружающей среды и хостов, что микроорганизмы колонизировать1,2.
Многие ученые изучают микробные взаимодействия для выявления новых антимикробных молекул. Одна из первых клинически важных молекул противомикробных препаратов была обнаружена в результате изучения микробных взаимодействий. Сэр Александр Флеминг наблюдал загрязняющий пенициллий spp. изолировать, что препятствует росту штамма стафилококка, что привело к открытию широко используемых антибиотик пенициллин3. Характеристика механизмов, которые микроорганизмы используют для антагонизма своих конкурентов, остается плодотворным ресурсом для открытия антимикробных молекул. Например, недавно было показано, что Streptomyces sp. штамм Mg1 производит антибиотики линейных, которые имеют литическую и деградативную активность против Bacillus subtilis4.
Кроме того, нерибосомолицко синтезированный пептид имени lugdunin был недавно обнаружен после наблюдения, что носовой комменсальный стафилококк lugdunensis ингибирует золотистый стафилококк5. Исследования также показали, что взаимные взаимодействия между микроорганизмами столь же сильны, как антагонистические взаимодействия для открытия антимикробных молекул. Например, многие грибок-фермерских муравьев в племени Attini гавани симбиотические бактерии под названием Pseudonocardia на их экзоскелет, который производит противогрибковые молекулы для ингибирования обязывает возбудителя их грибковой культурой6. Поскольку изучение микробных взаимодействий было полезным для обнаружения антимикробных молекул, использование высокопроизводительных экранов может привести к открытию новых антимикробных молекул.
Что касается стоимости и простоты работы, то методологии, используемые для изучения микробных взаимодействий, варьируются от простых до сложных. Например, анализ агар-штепсельной вилки является недорогим и простым методом, который может быть использован для исследования антагонизма между несколькими микроорганизмами7. Тем не менее, анализ агар-штепсельной вилки не является эффективной процедурой и может быть трудоемким для многих парных комбинаций. Для оценки влияния микробно производимых продуктов на целевые изоляты, представляющие интерес в высокой пропускной форме, многие лаборатории используют дискдиффузионные анализы8. Эти анализы просты и недороги и могут быть масштабируемыми для более высокого числа образцов7. Тем не менее, этот анализ требует генерации микробных экстрактов и может привести к вводящим в заблуждение результатам для определенных комбинаций организмов-мишеней и антибиотиков, таких как сальмонеллы и цефалоспорины9.
Предыдущие подходы опирались на изолированные компоненты для вырастающей реакции в организме-мишень, вместо того, чтобы позволить микроорганизмам взаимодействовать друг с другом. Это примечательно, потому что взаимодействие между микробами может вызвать производство “загадочных” антимикробных молекул, которые не производятся в монокультуре. Например, недавно было показано, что противомикробный кейицин производится только Micromonospora sp. при совместной культуре с Rhodococcus sp., который изолирован от той же губкимикробиом 10. Более сложные методологии взаимодействия обходят эту потенциальную монокультурную помеху. Например, iChip полезен для изоляции редких и трудно культивируемых бактерий из экологических образцов и позволяет наблюдать микробных взаимодействий через рост на месте11. Для детального изучения взаимодействий можно использовать матричную лазерную десорпацию/ионизацию масс-спектрометрии изображений (MALDI-TOF-IMS). Этот подход содержит подробную информацию о составе и распределении малых молекул и пептидов, производимых путем взаимодействия микробных колоний с высоким пространственным разрешением. MALDI-TOF-IMS также был использован в многочисленных исследованиях бактериальных взаимодействий для характеристики механизмов конкуренции12,13,14,15. Тем не менее, MALDI-TOF-IMS часто требует кропотливой подготовки образцов, специализированных экспертиз для работы оборудования, а также дорогих и специализированных масс-спектрометров. По этим причинам, это трудный метод для использования для высокой пропускной воды исследований. Таким образом, было бы полезно провести простой, масштабируемый и высокопроизводительный анализ совместной культуры микробных взаимодействий, который преодолевает многие ограничения вышеуказанных подходов.
Здесь представлен протокол высокой пропускной пролимки микробной кокультуры. Этот анализ прост и легко включен в уже существующие исследования микробных взаимодействий. В отличие от многих широко используемых методов для изучения микробных взаимодействий, наш метод прост, недорог и поддается исследованию большого количества взаимодействий. Эти анализы не только просты в исполнении, но материалы широко доступны у большинства лабораторных поставщиков или государственных ресурсов (например, библиотек и makerspaces). Следовательно, этот анализ является выгодным в качестве первой линии исследования для выявления и разбора интересных моделей среди многих парных комбинаций микроорганизмов, которые могут быть особенно полезны для исследования микробной экологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Антибиотики и другие вторичные метаболиты, которые посреднические микробные взаимодействия полезны для множества применений, в ключая открытие лекарств. В этом вопросе представлен протокол для совместно-культурных анализов для оценки большого количества микробных взаимодействий. Э…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Даниэля Мэй, Марка Шевретта и Дона Хоанга за критическое прочтение рукописи. Эта работа, в том числе усилия Кэмерона Р. Карри, была поддержана Университетом Висконсин-Мэдисон, Офис вице-канцлера по исследованиям и высшему образованию при финансировании из Висконсинского фонда исследований выпускников, финансирование также обеспечивается Национальные институты медицинских центров передового опыта в области трансляционных исследований (U19-AI109673-01). Рид М. Stubbendieck была поддержана Национальной библиотекой медицины учебный грант для вычислений и информатики в биологии и медицины Учебная программа (NLM 5T15LM007359). Спонсоры не принимали никакой роли в разработке, сборе и интерпретации данных или принятии решения о представлении работы для публикации.
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
Referências
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).
