En protokol præsenteres for at detektere cirkulerende ovarie tumorceller udnytter en skræddersyet foto akustisk flow system og målrettede folinsyre-udjævnede kobber sulfid nanopartikler.
Mange undersøgelser tyder på, at opregning af cirkulerende tumorceller (CTCs) kan vise løfte som en prognose værktøj for kræft i æggestokkene. De nuværende strategier til påvisning af ctc’er omfatter flowcytometri, mikrofluidisk-enheder og realtids polymerasekædereaktion (RT-PCR). På trods af de seneste fremskridt, metoder til påvisning af tidlig ovariecancer metastase stadig mangler følsomhed og specificitet kræves for klinisk oversættelse. Her præsenteres en ny metode til påvisning af ovarie cirkulerende tumorceller ved hjælp af photoacoustic flow flowcytometri (pafc), der udnytter en brugerdefineret tredimensionel (3D) trykt system, herunder et flow kammer og sprøjtepumpe. Denne metode udnytter folinsyre-udjævnede kobber sulfid nanopartikler (FA-CuS NPs) til at målrette SKOV-3 ovariecancerceller af PAFC. Dette arbejde viser affiniteten af disse kontrastmidler til kræftceller i æggestokkene. Resultaterne viser NP-karakterisering, PAFC-detektion og NP-optagelse ved Fluorescens mikroskopi, hvilket demonstrerer potentialet i dette nye system til påvisning af ovarie Ctc’er ved fysiologisk relevante koncentrationer.
Kræft i æggestokkene er en af de dødeligste gynækologiske maligniteter og resulterede i en anslået 184.800 dødsfald på verdensplan i 20181. Flere undersøgelser har vist sammenhængen mellem ovariecancer progression (dvs. metastase) og tilstedeværelsen af ctcs2,3,4. Den mest almindeligt forekommende metode til påvisning og isolering af Ctc’er udnytter Cellsearch-systemet, som er rettet mod EpCam-receptoren5. EpCam udtryk, dog, er nedreguleret i epitelial til mesenchymal overgang, som har været impliceret i kræft metastaser6. Trods forskud, nuværende kliniske teknologier stadig lider af lav nøjagtighed, høje omkostninger, og kompleksitet. På grund af disse ulemper, nye teknologier til opdagelse og optælling af æggestokkene CTCs er blevet et vigtigt område for forskning.
For nylig opstod pafc som en effektiv metode til ikke-invasiv påvisning af kræftceller, analyse af nanomaterialer og identifikation af bakterier7,8,9. PAFC adskiller sig fra traditionel fluorescens flow cytometri ved at detektere analytter i flow ved at udnytte foto akustik. Den foto akustiske effekt genereres, når laserlys absorberes af et materiale, der forårsager termo elastisk ekspansion, producerer en akustisk bølge, der kan påvises ved en ultralyd transducer10,11. Fordele ved pafc over traditionelle flow cytometri metoder omfatter enkelhed, nem oversættelse til kliniske indstillinger, og påvisning af ctcs på hidtil uset dybder i patientprøver12,13. Nylige undersøgelser har udnyttet pafc systemer til påvisning af celler ved hjælp af endogene og eksogene kontrast14,15. I nærheden af infrarød (NIR) lysabsorberende kontrastmidler såsom indocyaningrøn farvestof og metal NPS (f. eks. guld og CuS) er blevet anvendt til selektiv mærkning af celler og væv i kombination med foto akustisk billeddannelse16,17,18. På grund af den forbedrede indtrængningsdybde af NIR-lys i biologisk væv kan foto akustisk detektion af absorbenter udføres ved større dybder til kliniske anvendelser. På grund af det store potentiale for brug i klinikken har kombinationen af målrettede NIR-kontrastmidler med PAFC skabt betydelig interesse for påvisning af Ctc’er.
PAFC i kombination med målrettede kontraststoffer giver en forbedret tilgang til analyse af patientprøver med høj gennemløb med forbedret nøjagtighed og målrettet påvisning af Ctc’er. En af de vigtigste detekterings strategier for Ctc’er er den specifikke målretning af membran proteiner, der findes på cellen af interesse. En bemærkelsesværdig egenskab ved æggestokkene CTCs er over ekspression af folatreceptorer placeret på deres ydre membran19. Folatreceptor målretning er en ideel strategi for identifikation af æggestokkene Ctc’er i blodet, fordi endogene celler, som har højere ekspression af folinsyre receptorer, generelt er luminale og har begrænset eksponering for blodbanen20. Kobber sulfid NPs (CuS NPs) er for nylig blevet anerkendt for deres evne til at målrette folatreceptorer udtrykt på kræftceller21. Kombineret med deres biokompatibilitet, lethed af syntese, og absorption dybt i NIR, disse NP kontrastmidler gøre en ideel målretning strategi for påvisning af æggestokkene CTCs udnytte PAFC.
Dette arbejde beskriver forberedelsen af FA-CuS NPs og deres anvendelse til påvisning af kræftceller i æggestokkene i et foto akustisk flow system. CuS NPs modificeres med folinsyre til specifikt at målrette ovarie Ctc’er og udsender et foto akustisk signal, når det stimuleres med en 1.053 nm-laser. Resultaterne viser den vellykkede påvisning af kræftceller i æggestokkene inkuberet med disse foto akustiske kontrastmidler i PAFC systemet. Disse resultater viser påvisning af kræftceller i æggestokkene ned til koncentrationer på 1 celle/μL, og Fluorescens mikroskopi bekræfter en vellykket optagelse af disse partikler af SKOV-3 ovariecancerceller22. Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af FA-CuS NPs syntese, forberedelse af prøver til fluorescens mikroskopi, opførelse af det foto akustiske flow system, og den foto akustiske påvisning af æggestokkene cancerceller. Den præsenterede metode viser vellykket identifikation af æggestokkene CTCs i flow udnytte FA-CuS NPs. det fremtidige arbejde vil fokusere på den kliniske anvendelse af denne teknologi i retning af tidlig påvisning af ovariecancer metastaser.
Denne protokol er en enkel metode til påvisning af ovarie Ctc’er, der udnytter PAFC og et målrettet CuS-kontrastmiddel. Mange metoder er blevet udforsket til påvisning af æggestokkene ctcs, herunder mikrofluidisk enheder, RT-PCR, og fluorescens flow flowcytometri23,24,25. Disse spænder i kompleksitet, omkostninger og nøjagtighed, begrænser deres effektivitet i kliniske indstillinger. PAFC introducerer flere fordele i forh…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Madeleine Howell for hendes hjælp med syntese, Matthew Chest for hans hjælp til at designe flow systemet, og Ethan Marschall for at få hjælp til SolidWorks.
0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
3D Printed Tank | Custom-made | ||
Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |