Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico

Resumo

Um protocolo é apresentado para detectar células tumorais ovarianas circulantes utilizando um sistema de fluxo fotoacústico feito medida e nanopartículas de sulfeto de cobre cobertas de ácido fólico.

Resumo

Muitos estudos sugerem que a enumeração das células tumorais circulantes (CTCs) pode mostrar a promessa como uma ferramenta prognóstico para o câncer de ovário. As estratégias atuais para a detecção de CTCs incluem citometria de fluxo, dispositivos microfluídicos e reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR). Apesar dos avanços recentes, os métodos para a detecção da metástase precoce do câncer de ovário ainda não têm a sensibilidade e especificidade necessárias para a tradução clínica. Aqui, um novo método é apresentado para a detecção de células tumorais circulantes ovarianas por citometria de fluxo fotoacústico (PAFC) utilizando um sistema impresso tridimensional personalizado (3D), incluindo uma câmara de fluxo e uma bomba de seringa. Este método utiliza nanopartículas de sulfeto de cobre tampados com ácido fólico (FA-CuS NPs) para atingir células cancerosas ovarianas SKOV-3 pela PAFC. Este trabalho demonstra a afinidade destes agentes de contraste para pilhas ovarianas do cancro. Os resultados mostram caracterização de PN, detecção de PAFC e captação de NP por microscopia de fluorescência, demonstrando assim o potencial deste novo sistema para detectar CTCs ovarianos em concentrações fisiologicamente relevantes.

Introdução

O câncer de ovário é uma das neoplasias ginecológicas mais mortais e resultou em cerca de 184.800 mortes em todo o mundo em 2018¹. Vários estudos têm mostrado a correlação entre a progressão do câncer de ovário (ou seja, metástase) e a presença de CTCs^2,3,4. O método mais comum para detecção e isolamento de CTCs utiliza o sistema Cellsearch, que tem como alvo o receptor EpCam^5. Expressão EpCam, no entanto, é downregulated em epitelial para transição mesenchymal, que tem sido implicado na metástase do câncer⁶

Protocolo

1. Síntese e Funcionalização de Nanopartículas

NOTA: Síntese do FA-CuS NPs é alcançado usando um método de síntese de um pote adaptado de um protocolo publicado anteriormente²¹.
CUIDADO: Toda a síntese deve ocorrer em uma capa química ventilada da emuman.

1. Antes da síntese, filtre aproximadamente 300 mL de água desionizada (DI) através de um filtro estéril de 0,2 μm.
2. Limpe um frasco de fundo redondo de vidro de 250 mL com uma solução detergente e lave com água DI. Adicione 0,0134 g de CuCl₂ em 100 mL de água DI para criar uma solução de 1 mM.
3. Adicione 0,015 g de ácido fólico....

Resultados

A Figura 1A mostra uma imagem TÍPICA DE TEM das nanopartículas sintetizadas. O tamanho médio da nanopartícula típica é de aproximadamente 8,6 nm ± 2,5 nm. A medição de nanopartículas foi realizada no ImageJ. As funções do ponto inicial e da bacia hidrográfica foram aplicadas para separar as partículas para medição. Os diâmetros horizontais e verticais de cada partícula foram medidos perpendiculares uns aos outros e mais em média. Para dls, um.......

Discussão

Este protocolo é um método direto para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC e um agente de contraste CuS alvo. Muitos métodos têm sido explorados para a detecção de CTCs ovarianos, incluindo dispositivos microfluídicos, RT-PCR e citometria fluorescência^{fluxo 23,24,25}. Estes variam em complexidade, custo e precisão, limitando sua eficácia em ambientes clínicos. A PAFC introduz várias vantagens sobre esses métodos tradicio.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,025% de tripsina com EDTA	Corning	25-053-CL
0,2 µ m Unidade de filtração a vácuo de 1.000 mL	VWR	10040-440	Para filtrar grandes volumes de água DI.
0,2 µ m filtro de seringa estéril	VWR	28145-477
	impresso em 3D	Cartão de aquisição feito sob medida
	National Instruments	PXIe-5170R	250 MS/s, 8 canais, 14 bits
Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1.8KG	Detergente usado para limpar vidraria.
Filtros Centrífugos Amicon Ultra-15 Filtros Centrífugos	Millipore	UFC903024
Amicon Ultra-4	Hematocitômetro Millipore	UFC803024
Bright-Line	Hausser Scientific	1492
Cloreto de Cobre(II)	ACROS ORGANICS	de
	Thorlabs	LMH-10x-532	Para acoplar luz pulsada para fibra óptica.
Estágio de acoplamento	Newport	F-91-C1-T	Estágio para acoplamento de luz pulsada à objetiva. Contém FP-1A e LMH-10x-532
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath	Fisherbrand	Modelo CPX3800
Software de aquisição de dados	National Instruments	NI LabVIEW 2017 (32 bits)	LabVIEW usado para sincronizar pulsos de laser com aquisição de dados.
Software de Processamento de Dados	Mathworks	Matlab R2016a	Reconstruções e gráficos produzidos com o software Matlab.
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
Mandril de Fibra	Newport	FPH-DJ	Usado para segurar a fibra nua.
Acoplador de fibra	Newport	FP-1A	Estágio de 3 eixos para posicionar o mandril de fibra e a fibra óptica no foco da objetiva.
Ácido Fólico	Sigma-Aldrich	F7876-10G
Formvar Revestido TEM Grids	Electron Microscopy Sciences	FCF300--SB
Masterflex Tubing	Cole Parmer	EW-96420-14
McCoy's 5A Medium	ATCC	30-2007
Norm-Ject Seringas de 10 mL	HENKE SASS WOLF	4100-X00V0
Fibra Óptica	Thorlabs	FG550LEC	Usado para expor a amostra à luz pulsada.
PBS	Alfa Aesar	J62036
Penicilina Estreptomicina	GIBCO	15140-122
Laser Pulsado	RPMC Lasers Inc	Quantus-Q1D-1053	Fonte de laser pulsado com especificações 1053 nm, pulso de 8 ns, máximo de 10 Hz.
Pulsador/Receptor	Olympus	5077PR	Recebe, filtra e amplifica sinais fotoacústicos. Operado com ganho de 59 dB.
Instrumento de Tubo Capilar de Quartzo		QF150-75-10
RPMI Midum 1640 (1x) Livre de Ácido Fólico	Gibco	27016-021
Silicone	Momentive Performance Materials, Inc.	GE284
SKOV-3 Células	ATCC	HTB-77
Bicarbonato de Sódio	Sigma-Aldrich	S5761
Carbonato de Sódio	Sigma-Aldrich	S7795-500G
Grânulos de Hidróxido de Sódio	BDH	BDH9292-500G
Sulfeto de Sódio Nonahidratado	Sigma-Aldrich	431648-50G
Seringa Bombas	New Era Pump Systems Inc	DUAL-1000
Texas Red-X-Succinimydl éster	Invitrogen	1949071
Transdutor	Olynmpus	V214-BB-RM	Detector de ultrassom com frequência central de 50 MHz e largura de banda fracionada de -6 dB de 82%.
Solução azul de Trypan 0,4%	Amresco	K940-100ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
Gel de ultrassom	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic 100	Gel de ultrassom para acoplamento de transdutor

Tanque Objetivo Acoplamento 206532500