Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales
Summary
Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.
Abstract
Dentro de los organismos multicelulares, los tejidos y órganos maduros muestran altos grados de orden en las disposiciones espaciales de sus células constituyentes. Un ejemplo notable es dado por la epitelia sensorial, donde las células de las mismas o distintas identidades se reúnen a través de la adhesión de células celulares que muestran patrones planos altamente organizados. Las celdas se alinean entre sí en la misma dirección y muestran una polaridad equivalente a grandes distancias. Esta organización de la epitelia madura se establece en el curso de la morfogénesis. Para entender cómo se logra la disposición plana de la epitelia madura, es crucial realizar un seguimiento de la orientación celular y la dinámica de crecimiento con alta fidelidad espaciotemporal durante el desarrollo in vivo. Las herramientas analíticas sólidas también son esenciales para identificar y caracterizar las transiciones de local a global. La Drosophila pupa es un sistema ideal para evaluar los cambios orientados en la forma celular subyacentes a la morfogénesis epitelial. El epitelio pupal que desarrolla constituye la superficie externa del cuerpo inmóvil, permitiendo imágenes a largo plazo de animales intactos. El protocolo descrito aquí está diseñado para imaginar y analizar los comportamientos celulares a nivel global y local en la epidermis abdominal pupal a medida que crece. La metodología descrita se puede adaptar fácilmente a las imágenes de comportamientos celulares en otras etapas del desarrollo, tejidos, estructuras subcelulares u organismos modelo.
Introduction
Para lograr sus funciones, los tejidos epiteliales dependen plenamente de la organización espacial de sus componentes celulares. En la mayoría de las epitelias, las células no sólo se embalan unas contra otras para crear una capa de adoquines precisa, sino que se orientan en relación con los ejes del cuerpo.
La importancia funcional de la organización precisa del tejido es evidente en la epitelia sensorial, como el oído interno vertebrado y la retina. En el primer caso, el cabello y las células de apoyo se alinean en una dirección axial específica para detectar eficientemente entradas mecánicas como el sonido y el movimiento1,2. Del mismo modo, la organización espacial de las células fotorreceptores es esencial para lograr propiedades ópticas óptimas por la retina3. Por lo tanto, el control espacial de la posición y la orientación de la célula es de particular relevancia para la función fisiológica adecuada.
Drosophila es un insecto holometaboloso que sufre una transformación completa de sus estructuras corporales larvales a través de la metamorfosis, dando lugar a sus tejidos adultos. La Drosophila pupa es un excelente modelo para la imagen en vivo no invasiva de una variedad de eventos dinámicos, incluyendo la migración celular del desarrollo4,división celular y dinámica de crecimiento5, contracción muscular6, muerte celular7, reparación deheridas 8, y orientación celular9. En el Drosophilaadulto, el epitelio externo muestra un alto grado de orden. Esto se observa fácilmente en los arreglos de los tricomas (es decir, las protuberancias celulares procedentes de células epiteliales individuales) y las cerdas sensoriales en toda la superficie corporal de la mosca10. De hecho, los tricomas están alineados en filas paralelas que guían el flujo de aire11. La morfogénesis de la epitelia adulta y la disposición ordenada de las células individuales comienza durante la embriogénesis y culmina durante las etapas pupales. Mientras que en las divisiones celulares embrionarias, intercalaciones, y cambios de forma todos disminuyen el ordentisular12,13, esto se revierte en etapas posteriores de desarrollo, especialmente en etapas pupales, cuando la mosca se acerca a la madurez9.
La pupa Drosophila inmóvil proporciona un sistema ideal para evaluar la forma de la célula y los cambios de orientación. La epidermis abdominal pupal presenta ventajas especiales. Mientras que los precursores de la cabeza adulta, tórax, genitales, y apéndices crecen y se modelan desde etapas larvales, los histoblastos, que se integran en la epidermis larvaria, comienzan a crecer y diferenciar sólo en la pupariación14. Esta característica permite el seguimiento de todos los eventos espaciotemporales involucrados en el establecimiento del orden de los tejidos en su totalidad9.
Los histoblastos se especifican durante el desarrollo embrionario en posiciones contralaterales en cada segmento abdominal presuntivo. La epidermis abdominal dorsal del adulto deriva de nidos histoblastos localizados dorsolateralmente presentes en los compartimentos anterior y posterior15,,16. A medida que los histoblastos se expanden, reemplazando las células epiteliales larvales (LEC), los nidos contralaterales se fusionan en la línea media dorsal formando una hoja confluente17,18,19,20.
Este trabajo describe 1) una metodología para la disección, el montaje y la imagen en vivo a largo plazo de las drosophila pupae, y 2) métodos analíticos para estudiar la dinámica de la orientación celular y el crecimiento a alta resolución espaciotemporal. Aquí se proporciona un protocolo detallado, que abarca todos los pasos necesarios desde la preparación inicial de las pupas (es decir, la puesta en escena y la imagen) hasta la extracción y cuantificación de las características de direccionalidad y orientación. También describimos cómo inferir propiedades de tejido local del análisis de clones celulares. Todos los pasos descritos son mínimamente invasivos y permiten análisis en vivo a largo plazo. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar y aplicar fácilmente a otras etapas del desarrollo, tejidos u organismos modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El orden de largo alcance es una característica esencial de la mayoría de las unidades fisiológicas funcionales. Durante la morfogénesis, el orden se logra mediante la integración de instrucciones complejas implementadas con alta precisión temporal y espacial. Las restricciones múltiples y multinivel se integran en los arreglos de tejidos estereotipados.
La polaridad y la direccionalidad son fundamentales para ordenar la disposición espacial durante el desarrollo. La polaridad implica …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Martín-Blanco por los debates útiles. También damos las gracias a Nic Tapon (The Crick Institute, Londres, Reino Unido), el Bloomington Stock Center (Universidad de Indiana, EE. UU.) y FlyBase (por la anotación del gen Drosophila). Federica Mangione recibió el apoyo de una beca predoctoral JAE-CSIC. El laboratorio Martín-Blanco fue financiado por el Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P y BFU2017-82876-P) y de la Fundación Ramón Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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