Formålet med denne protokol er at visualisere Candida albicans celle form og lokalisering i pattedyrs mave-tarmkanalen.
Candida albicans er en svampe komponent i tarmen mikrobiota i mennesker og mange andre pattedyr. Selv om C. albicans ikke forårsager symptomer i de fleste koloniserede værter, den kommensal reservoir tjener som et opbevaringssted for smitsomme sygdomme, og tilstedeværelsen af høje svampe titre i tarmen er forbundet med inflammatorisk tarmsygdom. Her beskriver vi en metode til at visualisere C. albicans celle morfologi og lokalisering i en musemodel af stabil gastrointestinal kolonisering. Kolonisering er etableret ved hjælp af en enkelt dosis af C. albicans i dyr, der er blevet behandlet med orale antibiotika. Segmenter af tarm vævet er fastgjort på en måde, der bevarer arkitekturen af luminale indhold (mikroorganismer og slim) samt værten slimhinde. Endelig udføres fluorescerende in situ-hybridisering ved hjælp af sonder mod svampe-rRNA til farvning af C. albicans og hyphae. En vigtig fordel ved denne protokol er, at det giver mulighed for samtidig observation af C. albicans celle morfologi og dens rumlige Association med værtsstrukturer under gastrointestinal kolonisering.
Candida albicans er en svampe-kommensal samt en opportunistisk Human patogen. Denne gær mangler en defineret miljømæssig niche og i stedet udbreder inden for mave-tarmkanalen, hud, og urogenitale tarmkanalen af mennesker og andre pattedyr1. Der henviser til, at tidlig forskning i C. albicans primært fokuserede på virulens potentiale, men flere nylige rapporter tyder på, at almindeligt formerings organismer i tarmen kan spille en vigtig rolle i den normale sundhed, herunder immun udviklingen af vært2,3,4. For at lette undersøgelser af C. albicans commensalism i pattedyr tarmen, vi udviklet en musemodel af stabile GI kolonisering og en fluorescens in situ hybridisering (fisk)-baserede metode til at visualisere svampe gærceller og hyfer i tarm lumen.
Med nogle undtagelser5, laboratorie-opdrættet mus typisk udviser resistens over for svampe kolonisering af fordøjelseskanalen. Koloniserings resistens menes at være medieret af specifikke bakteriearter; Men, dette kan overvindes ved behandlingaf dyrene med antibiotika6,7 eller brug af en kemisk defineret kost, der formentlig ændrer bakteriearter sammensætning8,9. På samme måde har brugen af bredspektrede antibiotika i mennesker været forbundet med C. albicans overvækst og udbredelse10. Vores murine koloniserings model bruger bredspektrede antibiotika til at etablere C. albicans kolonisering af immunkompetente, konventionelt opdrættede mus. Penicillin og streptomycin leveres i dyrenes drikkevand i en uge før sonde med 108 kolonidannende enheder (cfus) af C. albicans. Så længe det antibiotika-inbrugte vand fortsættes, C. albicans vil udbrede gennem mave-tarmkanalen, nå fækale titre af 106− 108 cfus/g. På trods af det høje niveau af svampe kolonisering, dyr forbliver sunde og tage på i vægt i samme tempo som ikke-inficerede kontroller. Denne model er blevet brugt med succes til at screene for og karakterisere flere C. albicans commensalism faktorer11,12.
Ligesom andre medlemmer af svamperiget, C. albicans er i stand til enorme morfologiske plasticitet13. Under in vitro betingelser, det har vist sig at overgangen mellem mindst seks unicellulære gær celletyper, samt multicellulære hyfer og pseudohyphae. Den gær-til-hypha overgang er en af sine bedst karakteriserede virulens attributter, og hyfer og pseudohyphae dominerer i de fleste pattedyr sygdomsmodeller, samt i inficerede humane væv. For at bestemme C. albicans lokalisering og celle morfologi i murine fordøjelseskanalen, udviklede vi en fisketeknik til farvning af gær og hyfer i faste histologiske sektioner. Sonderne består af fluorescently mærkede DNA-oligonukleotider, der hybridiserer til svampe-23S ribosomale RNA (rRNA), som fordeles i hele svampe-cytoplasmaet. Fordi Host væv er fastgjort på en måde, der bevarer den tredimensionale arkitektur af tarmen, herunder værten slimhinde, fordøjelsessystemet materiale, bakteriel mikrobiota, og slim i tarmen lumen, denne teknik tillader lokalisering af svampe celler med hensyn til disse landemærker, når de farves. FISKE teknikken sammenlignes positivt med traditionelle histologiske pletter for svampe, såsom periodiske syre Schiff (PAS) eller Gomoris Methenamin-sølv (GMS), samt kommercielt tilgængelige svampedræbende antistoffer, fordi disse reagenser ikke er specifikke for C. albicans. Desuden, standard fikater fjerne slim lag og forstyrre andre indhold af tarmen lumen14,15.
I denne artikel, vi giver detaljerede instruktioner til etablering af høj kvalitet C. albicans kolonisering af musen GI-kanalen, for dissektion af fordøjelseskanalen fra aflives dyr, for vævs fiksering på en måde, der bevarer luminale og til påvisning af C. albicans i værts vævet ved hjælp af fisk. Ud over vilde type og mutante stammer af C. albicans, kan sonde teknikken bruges til at levere andre mikroorganismer. Fikserings teknikken ville være nyttig for enhver undersøgelse, hvor bevarelse af tarmindholdet ønskes. FISKE proceduren kan gennemføres inden for en dag og kan bruges til at lokalisere flere svampearter ved hjælp af flere, differentielt mærkede sonder.
Den metode, der er beskrevet her, giver mulighed for visualisering af C. albicans gær og hyfer i GI-skrifter af commensally koloniseret mus af enhver køn eller stamme. FISKEN sonde hybridizes til 23S rRNA, som er fordelt i hele svampe cytoplasmaet. Vores metode blev tilpasset fra en tidligere rapporteret protokol til visualisering af Gut bakterier20. Fordi C. albicans ændrer sin morfologi i værten, metoden er nyttig til at overvåge svampe celle form samt lokalisering. For eksempel har vi brugt denne metode til at modbevise den hypotese, at gær dominerer i hele fordøjelseskanalen, og at afsløre uoverensstemmelser mellem in vivo og in vitro fænotyper af visse “filamentation-defekte” mutanter12.
Flere musemodeller findes for C. albicans kommensal kolonisering. Mikrobiota af laboratorie mus og mennesker er forskellige og, i mus, brug af antibiotika eller en specialiseret kost er forpligtet til at etablere stabile kolonisering. Behandling med antibiotika øger også C. albicans kolonisering af mennesker og er en stor risikofaktor for dissemineret sygdom10. De antibiotika, der anvendes i denne undersøgelse er relativt billige og give pålidelige fald i bakterien mikrobiota. Bemærk, at antibiotika bruges til at mindske byrden af antagonistiske bakteriearter, ikke at fjerne alle bakterier fra dyrene. Hvis forskerne ønsker at studere C. albicans-Host interaktioner i fravær af bakterier eller for at undgå brug af antibiotika eller en særlig diæt, kan kimfri dyr erstattes af konventionelt opdrættede dyr; gnotobiotiske mus udviser dog visse immun-og anatomiske abnormiteter og kan derfor ikke være egnede til alle formål.
Flere trin er vigtige for vellykket fisk farvning: den anbefalede fiksering metode er afgørende for at bevare den strukturelle integritet af GI-væv, især det skrøbelige indhold af tarm lumen, såsom slim lag og den tredimensionale organisering af svampe og bakterier16. Bemærk venligst, at mange almindeligt anvendte fikserings løsninger, der indeholder vand, er yderst skadelige for luminale arkitekturen. De fikseringsmidler og opløsninger til vask, der er anbefalet i denne protokol, indeholder ikke vand, og det er vigtigt at undgå kontaminering med vand. Et andet kritisk trin er hybridiserings trinnet, hvor det er vigtigt at undgå fordampning af hybridiserings opløsningen under inkubation af slides i hybridiseringsovn. Vi foreslår, at du placerer diasene i en vandtæt beholder for at undgå dette problem. Alternativt kan man bruge vandtætte hybridiserings kamre som dem, der oprindeligt blev brugt til hybridisering af mikroarrays.
En C. albicans-specifik fiske sonde er beskrevet i denne protokol. Men fordi mange laboratorie opdrættede mus ikke indeholder c. albicans eller andre svampe som en del af deres naturlige tarm mikrobiota, kan en pande svampe sonde specifikt bejdske c. albicans i eksperimentelt koloniseret dyr. Udskiftning af en pande svampe sonde kan være ønskelig på grund af dens overlegne hybridiserings egenskaber og højere signal-støj-forhold. Hvis pande svampe sonden anvendes som en pseudo specifik sonde til c. albicans, er det vigtigt at dokumentere en manglende farvning i ikke-inficerede dyr (dvs. behandlet med antibiotika, men ikke C. albicans). Farvning af et ikke-koloniseret kontrol dyr er også nyttigt til at vurdere baggrunds farvning, der kan opstå som følge af overholdelse af fiske provler til levnedsmiddel partikler. Samlet set, brugen af fisk sonder tilbyder øget specificitet over de fleste andre metoder til farvning af svampe, såsom Calcofluor hvid (som pletter chitin, en cellevæg komponent, der kan variere mellem celletyper), GMS, eller kommercielt tilgængelige svampedræbende antistoffer. Desuden gør fiske farvning det muligt at samfarende flere organismer ved hjælp af differentielt mærkede fiske sonder til artsspecifikke Rrna’er.
En advarsel af denne teknik er, at visse C. albicans gærcelle typer synes meget ens af fisk (for eksempel de uigennemsigtige og Gut celletyper). For at skelne mellem disse celletyper, ville det være nyttigt at udvikle hybridiserings sonder til celletype-specifikke svampe Mrnaer. Ikke desto mindre har fiske teknikken i sin nuværende form allerede afsløret overraskende uoverensstemmelser mellem in vivo og in vitro adfærd af C. albicans mutanter evalueret under begge betingelser12, hvilket indikerer komplekse interaktioner i naturligt kommensal miljø, der ikke er tilstrækkeligt efterfulgt af eksisterende in vitro-assays. Yderligere undersøgelser af forskellige C. albicans pletter i ekstra vildtype og mutant værter vil sandsynligvis give yderligere indsigt i svampe-vært interaktioner. Især vil det være lærerigt at profil C. albicans i modeller af inflammatorisk tarmsygdom, som er forbundet med høje titre af c. albicans i mennesker21, og andre modeller af c. albicans overvækst og sygdom. FISKE teknikken kan også kombineres med immun histokemi for at plette specifikke værtsceller. Samlet set den metode, der præsenteres her giver en rimelig hurtig og pålidelig måde at bestemme C. albicans lokalisering og morfologi i pattedyr mavetarmkanalen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Carolina Tropini, Katharine ng, Justin Sonnenburg, og KC Huang for vejledning i udviklingen af fiske teknikken. Teresa O’Meara gav nyttige kommentarer til manuskriptet, og Miriam Levy hjalp med fotografering. Dette arbejde blev støttet af NIH Grants R01AI108992, R01DK113788, og en Burroughs velkomst pris i patogenesen af smitsomme sygdomme.
1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
LB | can be substituted from any vendor | ||
Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
YEPD | can be substituted from any vendor |