Formålet med denne protokollen er å visualisere Candida albicans celle form og lokalisering i pattedyr tarmen.
Candida albicans er en sopp komponent i tarm bakterieflora hos mennesker og mange andre pattedyr. Selv om C. albicans ikke forårsaker symptomer i de fleste kolonisert verter, gjør Commensal reservoaret fungerer som et oppbevaringssted for smittsomme sykdommer, og tilstedeværelsen av høye fungal titers i tarmen er assosiert med inflammatorisk tarmsykdom. Her beskriver vi en metode for å visualisere C. albicans celle morfologi og lokalisering i en mus modell av stabil Gastrointestinal kolonisering. Kolonisering er etablert ved hjelp av en enkelt dose av C. albicans i dyr som har blitt behandlet med oral antibiotika. Segmenter av tarmen vev er løst på en måte som bevarer arkitekturen av luminal innhold (mikroorganismer og Slim) samt verten mucosa. Endelig er fluorescerende in situ hybridisering utføres ved hjelp av sonder mot sopp rRNA å beis for C. albicans og hyfer. En viktig fordel med denne protokollen er at den tillater samtidig observasjon av C. albicans celle morfologi og dens romlige tilknytning til verts strukturer under Gastrointestinal kolonisering.
Candida albicans er en sopp Commensal, så vel som en opportunistiske menneskelig patogen. Dette gjær mangler en definert miljømessige nisje og i stedet sprer innen Gastrointestinal (GI) skrift, hud, og urin skrift av mennesker og andre pattedyr1. Mens tidlig forskning på C. albicans fokuserte primært på dens virulens potensial, flere nylige rapporter tyder på at commensally spre organismer i tarmen kan spille viktige roller i normal helse, inkludert immun utvikling av Host2,3,4. For å lette undersøkelser av C. albicans commensalism innen pattedyr tarmen, utviklet vi en mus modell av stabil gi kolonisering og en fluorescens in situ HYBRIDISERING (fisk)-basert metode for å visualisere sopp gjærceller og hyfer innenfor tarm lumen.
Med noen unntak5, laboratorium-avlet mus typisk vise motstand mot sopp kolonisering av fordøyelseskanalen. Kolonisering motstand antas å være formidlet av bestemte bakterielle arter; Men, dette kan overvinnes ved behandling av dyrene med antibiotika6,7 eller bruk av en kjemisk definert diett som antagelig endrer bakterielle arter sammensetning8,9. På samme måte, hos mennesker, har bruken av bredspektret antibiotika vært forbundet med C. albicans overvekst og formidling10. Vår murine kolonisering modell bruker bredspektret antibiotika for å etablere C. albicans kolonisering av immunkompetente, konvensjonelt oppdratt mus. Penicillin og Streptomycin er gitt i dyrenes drikkevann i en uke før gavage med 108 koloni forming enheter (CFUs) av C. albicans. Så lenge antibiotika-tilført vann fortsetter, C. albicans vil spre gjennom gi-tarmkanalen, nå avføring titers av 106− 108 CFUs/g. Til tross for det høye nivået av sopp kolonisering, dyr forblir friske og få vekt på samme hastighet som infisert kontroller. Denne modellen har blitt brukt med hell til skjermen for og karakterisere flere C. albicans commensalism faktorer11,12.
I likhet med andre medlemmer av fungal riket, er C. albicans i stand til enorme morfologiske plastisitet13. Under in vitro forhold, har det vist seg å overgangen mellom minst seks encellede gjær celletyper, samt flercellede hyfer og pseudohyphae. Den gjær-til-hypha overgangen er en av sine best-preget virulens attributter, og hyfer og pseudohyphae dominerer i de fleste pattedyr sykdom modeller, så vel som i infiserte menneskelige vev. For å fastslå C. albicans lokalisering og celle morfologi innenfor murine fordøyelseskanalen, utviklet vi en Fish teknikk for farging gjær og hyfer i faste histologiske seksjoner. Den sonder består av fluorescensmerkete merket DNA oligonukleotider som hybridize til fungal 23S ribosomal RNA (rRNA), som er distribuert gjennom fungal cytoplasma. Fordi verten vev er løst på en måte som bevarer den tredimensjonale arkitekturen i tarmen, inkludert verten mucosa, fordøyelsesenzymer, bakteriell bakterieflora, og mucus i tarmen lumen, tillater denne teknikken lokalisering av fungal celler med hensyn til disse landemerkene når beiset. FISH teknikken sammenligner gunstig til tradisjonelle histologiske flekker for sopp, slik som periodisk acid Schiff (PAS) eller Gomori ‘ s Methenamine-Silver (GMS), så vel som kommersielt tilgjengelige Antifungal antistoffer, fordi disse reagensene ikke er spesifikke for C. albicans. Videre standard fiksativene fjerne mucus laget og forstyrre annet innhold i tarmen lumen14,15.
I denne artikkelen gir vi detaljerte instruksjoner for å etablere høyverdig C. albicans kolonisering av musen gi-tarmkanalen, for Disseksjon av fordøyelseskanalen fra euthanized dyr, for vev fiksering på en måte som bevarer luminal arkitektur, og for påvisning av C. albicans innen vert vev ved hjelp av fisk. I tillegg til vill type og mutant stammer av C. albicans, den gavage teknikken kan brukes til å levere andre mikroorganismer. Fiksering teknikken vil være nyttig for enhver studie der bevaring av gut innholdet er ønsket. FISKEN fremgangsmåte kan fullført innen en dag og kan brukes å lokalisere mangfoldig fungal art av benytter mangfoldig, differensielt benevnt sonder.
Metoden beskrevet her kan for visualisering av C. albicans gjær og HYFER i gi traktater av commensally kolonisert mus av noe kjønn eller belastning. FISKEN sonde hybridizes til 23S rRNA, som er fordelt gjennom fungal cytoplasma. Vår metode var tilpasset fra en tidligere rapportert protokoll for å visualisere gut bakterier20. Fordi C. albicans endrer sin morfologi i verten, er metoden nyttig å overvåke sopp celle form og lokalisering. For eksempel har vi brukt denne metoden for å motbevise hypotesen om at gjær dominerer gjennom fordøyelseskanalen, og for å avdekke avvik mellom in vivo og in vitro fenotyper av visse “filamentation-defekt” mutanter12.
Flere musemodeller finnes for C. albicans Commensal kolonisering. Bakterieflora av laboratoriet mus og mennesker er distinkte, og i mus, bruk av antibiotika eller en spesialisert diett er nødvendig for å etablere stabil kolonisering. Behandling med antibiotika også forbedrer C. albicans kolonisering av mennesker og er en stor risikofaktor for spres sykdom10. Antibiotika som brukes i denne studien er relativt billig og gir pålitelig nedgang i bakteriell bakterieflora. Merk at antibiotika brukes til å redusere byrden av fiendtlige bakterielle arter, for ikke å eliminere alle bakterier fra dyrene. Hvis forskerne ønsker å studere C. albicans-vert interaksjoner i fravær av bakterier eller for å unngå bruk av antibiotika eller en spesiell diett, bakterie-frie dyr kan erstatte konvensjonelt oppdratt dyr; men gnotobiotic mus viser visse immun-og anatomiske misdannelser, og er derfor kanskje ikke egnet for alle formål.
Flere trinn er viktig for vellykket fisk farging: den anbefalte fiksering metoden er avgjørende for å bevare den strukturelle integriteten til GI vev, spesielt den skjøre innholdet i tarmen lumen, slik som mucus laget og de tre-dimensjonale organisering av sopp og bakterier16. Vær oppmerksom på at mange ofte brukte fiksering løsninger som inneholder vann er svært skadelig for luminal arkitektur. Fiksativene og løsningene for etter fikserings vasker som anbefales i denne protokollen, inneholder ikke vann, og det er viktig å unngå forurensning med vann. Et annet kritisk trinn er hybridisering trinnet, der det er viktig å unngå fordamping av hybridisering løsningen under inkubasjons av lysbildene i hybridisering ovnen. Vi anbefaler at du plasserer lysbildene i en vanntett beholder for å unngå dette problemet. Alternativt kan man bruke vanntette hybridisering kamre som de som opprinnelig ble brukt til hybridisering av Microarrays.
En C. albicans-spesifikk Fish probe er beskrevet i denne protokollen. Men fordi mange laboratorie-reist mus ikke inneholder C. albicans eller andre sopp som en del av deres naturlige gut bakterieflora, en panfungal sonde kan spesielt flekken C. albicans i eksperimentelt kolonisert dyr. Substitusjon av en panfungal sonde kan være ønskelig på grunn av sin overlegne hybridisering egenskaper og høyere signal-til-støy-forhold. Hvis panfungal sonden brukes som en pseudospecific sonde for C. albicans, er det viktig å dokumentere en mangel på flekker i friske dyr (dvs. behandlet med antibiotika, men ikke C. albicans). Farging av en noncolonized kontroll dyr er også nyttig å vurdere bakgrunnen flekker som kan oppstå fra overholdelse av fisk sonder til mat partikler. Samlet sett tilbyr bruk av fisk sonder forbedret spesifisitet over de fleste andre metoder for farging sopp, for eksempel Calcofluor hvit (som flekker kitin, en cellevegg komponent som kan variere mellom celletyper), GMS, eller kommersielt tilgjengelige soppdrepende antistoffer. Dess, FISH flekker gjør det mulig for costaining av flere organismer bruker differensielt merket FISH sonder til arter-spesifikke rRNAs.
En påminnelse om denne teknikken er at enkelte C. albicans gjær celletyper vises svært like av fisk (for eksempel den UGJENNOMSIKTIGE og gut celletyper). For å skille mellom disse celletyper, ville det være nyttig å utvikle hybridisering sonder til celle type-spesifikke fungal mRNAs. Likevel, i sin nåværende form, har FISKEN teknikken allerede avdekket overraskende avvik mellom in vivo og in vitro atferd av C. albicans mutanter evaluert under begge forhold12, noe som indikerer komplekse interaksjoner i naturlig Commensal miljø som ikke er tilstrekkelig etterlignet av eksisterende in vitro-analyser. Videre studier av forskjellige C. albicans flekker i flere vill-type og mutant verter vil trolig gi ytterligere innsikt i fungal-Host interaksjoner. Spesielt vil det være lærerikt å profil C. albicans i modeller av inflammatorisk tarmsykdom, som er forbundet med høy titers av c. albicans hos mennesker21, og andre modeller av c. albicans overvekst og sykdom. FISKEN teknikken kanskje likeledes være kombinert med immunhistokjemi å flekk spesifikk vert celler. Samlet, metoden som presenteres her gir en rimelig rask og pålitelig måte å fastslå C. albicans lokalisering og morfologi i pattedyr gi-tarmkanalen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Carolina Tropini, Sonnenburg, Justin, og KC Huang for veiledning i utviklingen av FISH teknikken. Teresa O ‘ meara gitt nyttige kommentarer på manuskriptet, og Miriam Levy assistert med fotografering. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01AI108992, R01DK113788, og en Burroughs velkommen Award i patogenesen av smittsomme sykdommer.
1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
LB | can be substituted from any vendor | ||
Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
YEPD | can be substituted from any vendor |