In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

Abstract

Décadas de pesquisa em muitos organismos modelo levaram ao conceito atual de plasticidade sináptica subjacente aprendizagem e formação de memória. Mudanças induzidas pela aprendizagem na transmissão sináptica são muitas vezes distribuídas em muitos neurônios e níveis de processamento no cérebro. Portanto, os métodos para visualizar a plasticidade sináptica dependente da aprendizagem através dos neurônios são necessários. A mosca de fruto Drosophila melanogaster representa um organismo modelo particularmente favorável para estudar os circuitos neuronais de aprendizagem subjacente. O protocolo aqui apresentado demonstra uma maneira em que os processos subjacentes à formação de memórias olfatório associativas, ou seja, atividade sináptica e suas mudanças, podem ser monitorados in vivo. Usando a ampla gama de ferramentas genéticas disponíveis na Drosophila, é possível expressar especificamente indicadores de cálcio geneticamente codificados em populações de células determinadas e até mesmo células individuais. Fixando uma mosca no lugar, e abrindo a cápsula principal, é possível visualizar a dinâmica do cálcio nestas pilhas ao entregar estímulos olfactory. Além disso, demonstramos uma set-up em que a mosca pode ser submetida, simultaneamente, a choques eléctricos para o corpo. Isto fornece um sistema em que as moscas podem submeter-se ao condicionamento olfactory clássico-por meio de que um odor previamente ingênuo é aprendido para ser associado com a punição de choque elétrico-ao mesmo tempo que a respresentação deste odor (e outros odores não treinados) é observada no cérebro através de microscopia de dois fótons. Nosso laboratório relatou previamente a geração de sensores synaptically localizados do cálcio, que permite que um confinar os sinais fluorescentes do cálcio aos compartimentos pre-ou pós-sináptica. A microscopia de dois fótons fornece uma maneira de resolver espacialmente estruturas finas. Nós exemplificamos isso, concentrando-se em neurônios integrando informações do corpo do cogumelo, um centro de ordem superior do cérebro do inseto. Globalmente, este protocolo fornece um método para examinar as conexões sinápticas entre os neurônios cuja atividade é modulada como resultado do aprendizado olfativo.

Introduction

Decifrar onde e como a informação é adquirida no cérebro através da aprendizagem e, posteriormente, armazenada como memória constitui uma das tarefas mais desafiadoras na neurociência¹. A pesquisa neurocientífica levou ao conceito de mudança na transmissão sináptica como substrato neuronal que está subjacente à formação de aprendizagem e memória^2,3. É supor que, durante a aprendizagem, as conexões sináptica entre os conjuntos neuronal que são ativos durante a percepção de um estímulo tornam-se modificados de modo que seu teste padrão combinado da atividade possa ser recuperado durante a....

Protocol

1. moscas transgênicas de frutas, Drosophila melanogaster

1. A fêmea transversal do Virgin e do macho voa (levantado em 25 ° c na umidade relativa de 60% em um ciclo claro/escuro de 12 h) que carreg as construções desejadas de Gal4 e de UAS²⁵, respectivamente, para produzir as moscas em que os neurônios específicos do interesse expressam um genetically codificado indicador de cálcio.
2. Age a progêia feminina da Cruz acima até que estejam na faixa de 3-6 dias após a eclosão. As moscas fêmeas são preferíveis por causa de seu tamanho ligeiramente maior.

2. preparação da mosca da fruta para a ....

Results

Um exemplo de imagens adquiridas com o protocolo acima pode ser observado na Figura 2. d Homer-GCaMP3 é expressado em um neurônio da saída do MB cujos os dendritos inervam o compartimento 1 do MB γ-lóbulo (o neurônio é denominado MVP2^28,29) e é visado genetically usando a linha Split-Gal4 MB112C¹⁶. Também, demonstrado é a diferença na localização subcelular de um citos.......

Discussion

A dissecção dos circuitos neurais subjacentes à aprendizagem e à memória é um objetivo proeminente no campo da neurociência. A acessibilidade genética da Drosophila e a amplitude e facilidade de testes comportamentais fazem desta uma ferramenta ideal para investigar tais fenômenos. Aqui, um método é apresentado com o qual é possível visualizar, dentro de moscas individuais, a modulação que ocorre em um nível subcelular como resultado do condicionamento olfativo. Ao realizar o pré-treinamento e a visualização pós.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	O5284	Produto químico usado como odorante
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	218405	Produto químico usado como odorante
4-metilciclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	153095	Produto químico usado como odorante
Filtro passa-banda para EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha
Fita adesiva transparente	Tesa SE, Norderstedt, Alemanha		Fita adesiva transparente padrão
Mandíbulas côncavas-convexas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	10053-09	Porta-lâminas com mandíbulas côncavas-convexas Pinças
finas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	11412-11	Pinça com ponta 0,1 x 0,06 mm
Agulha hipodérmica	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Alemanha	4665120	1,20x40mm
Pinos de inseto Minutien	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	26002-10	Diâmetro 0,1 mm, ponta 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Reino Unido	953683	Cola fotopolimerizável azul
Lâmina de microscópio	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemanha	0656.1	Objetiva padrão lâmina 76 x 26 mm
Óleo mineral	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Usado como diluente para odores
Laser Ti-Sapphire com bloqueio de modo Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, EUA		Laser de femtossegundo infravermelho ajustável
Microscópio multifotônico LSM 7MP equipado com detectores BiG Carl	Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha		Microscópio multifotônico, várias empresas fornecem dispositivos semelhantes.
Objetiva de imersão em água Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha	421452-9900-000	Objetiva W "Plan-Apochromat" 20x/1,0 DIC M27 Solução
de Ringer			KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sacarose, pH = 7,4
Faca	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5,0 mm Profundidade da lâmina reta restrita
Lâmina de bisturi cirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	0303	Produto nº 11
Cabo de bisturi cirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	0907	Produto nº 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software para receber um trigger do dispositivo de entrega de odor e o dispositivo de aplicação de choque elétrico (fonte de alimentação) para interagir com o software ZEN da Zeiss que controla o microscópio.	Escrito sob medida e disponível mediante solicitação	n.a.n.a	.