Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons

Summary

Vi præsenterer tre enkle in vitro-analyser-den lange afstande migration assay, co-kultur migration assay, og kemo-attraktion assay-at kollektivt evaluere funktionerne i menneskelige stamceller afledt periventtrikulære endotelceller og deres interaktion med GABAergic interneuroner.

Abstract

Hjernens vaskulaturs rolle i udviklingen af nervesystemet og ætiologi en hjernesygdom får i stigende grad opmærksomhed. Vores seneste undersøgelser har identificeret en særlig population af vaskulære celler, de periventrikulære endotelceller, der spiller en afgørende rolle i migration og distribution af forhjernen GABAergic interneuroner under embryonaludvikling. Dette, kombineret med deres celle-autonome funktioner, hentyder til nye roller periventrikulære endotelceller i patologi af neuropsykiatriske lidelser som skizofreni, epilepsi, og autisme. Her har vi beskrevet tre forskellige in vitro-analyser, der tilsammen evaluerer periventrikelendotelcellers funktioner og deres interaktion med GABAergic interneuroner. Brug af disse analyser, især i en menneskelig sammenhæng, vil give os mulighed for at identificere forbindelsen mellem periventrikulære endotelceller og hjernesygdomme. Disse analyser er enkle, lave omkostninger, og reproducerbare, og kan nemt tilpasses til enhver tilhænger celletype.

Introduction

Endotelceller danner foring af blodkar og mægle vigtige funktioner, der omfatter vedligeholdelse af fartøjets væg permeabilitet, regulering af blodgennemstrømningen, blodplade sammenlægning, og dannelse af nye blodkar. I hjernen, endotelceller udgør en del af en kritisk blod – hjerne-barriere, der stramt styrer udveksling af materialer mellem hjernen og blodbanen¹. Vores undersøgelser i det seneste årti har identificeret nye neurogene roller hjerne endotelceller, der har betydelige konsekvenser for hjernens udvikling og adfærd^2,3,4,5. Vi har vist, at musen embryonale forhjernen er vaskulariseret af to forskellige undertyper af fartøjer, pial fartøjer og periventrikulære fartøjer, der adskiller sig i anatomi, oprindelse, og udviklingsmæssige profil². Endotelceller foring disse to fartøjsundertyper viser tydelige forskelle i deres genekspressionsprofiler. Mens pial endotelceller meste udtrykke gener relateret til betændelse og immunrespons, periventrikel endotelceller er unikt beriget i udtryk for gener, der almindeligvis er forbundet med neurogenese, neuronal migration, kemotaxis, og axon vejledning³. Periventtricular endotelceller også hus en roman GABA signalering vej, der adskiller sig fra den traditionelle neuronale GABA signalering vej⁵. Samtidig med sit genudtryk, periventrikulære endotelceller blev fundet at regulere migration og distribution af GABAergic interneuroner i udviklingslandene neocortex. Under embryonale udvikling, periventrikulære endotelceller gennemgå langdistance migration langs en ventral-dorsale gradient at etablere den periventrikulære vaskulære netværk^2,3. Denne migrationsrute afspejles en dag senere af interneuroner. Migrerende interneuroner interagerer fysisk med det præformede periventrikulære vaskulære netværk og bruger det som en guiderail for at nå deres endelige destination i neocortex. Ud over at fungere som et fysisk substrat, periventrikulære endotelceller tjene som kilde til navigationssignaler til migrerende neuroner. Periventrikulære endotelcelleudskillede GABA guider interneuronmigration og regulerer deres endelige distributionsmønstre⁴. Defekter i interneuron migration og distribution er forbundet med neuropsykiatriske lidelser såsom autisme, epilepsi, skizofreni og depression^6,7,8,9,10. Derfor, undersøgelse af periventrikulære endotelcelle funktioner og deres indflydelse på interneuron migration i menneskelig sammenhæng bliver afgørende for at løse patogenesen af disse lidelser.

Vi har genereret humane periventrikulære-lignende endotelceller fra menneskelige embryonale stamceller i vores laboratorium^11,ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller (iPSC) teknologi^12,13. For at validere, om humane periventrikulære endotelceller trofast efterligner museperiventrikulære endotelceller, og for kvantitativt at vurdere deres indflydelse på interneuronmigration, udviklede vi tre in vitro-analyser: en langdistance-migrationsanalyse, en co-kultur migration assay og en kemo-attraktionsanalyse. Her beskriver vi protokoller for disse analyser i detaljer. Alle tre analyser er baseret på brugen af silikone kultur skær til at skabe en lille rektangulær patch af celler (af faste dimensioner) omgivet af celle-fri rum. Migrationsafstanden evalueres ved at måle afstanden mellem cellernes endelige positioner fra kanten af den rektangulære patch, der er skitseret på dag 0. I den lange afstande migration assay, menneskelige periventrikulære endotelceller er seedet som et plaster i midten af en 35 mm fad, og de afstande, der rejses af cellerne over en lang række tid beregnes. I co-kultur migration assay, menneskelige periventrikulære endotelceller er co-seedede med menneskelige interneuroner som en patch i en 35 mm parabol. Denne opsætning gør det muligt at undersøge effekten af direkte fysiske interaktioner af disse to celletyper på hastigheden af migration af interneuroner. Den kemo-attraktion assay måler migration af interneuroner som reaktion på kemo-attraktive signaler udskilles af menneskelige periventtricular endotelceller. Interneuroner er seedet som en rektangulær plet, med menneskelige periventrikulære endotelceller og kontrol ikke-periventtricular endotelceller seedet som lignende størrelse patches på begge sider. Hver af celleplastrene er adskilt af et cellefrit hul på 500 μm. Reaktion af interneuroner vurderes ved at kvantificere antallet af celler, der er migreret mod periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontrol af ikke-periventrikulære endotelceller.

Disse analyser giver en robust vurdering af humane periventrikulære endotelcellefunktioner og deres indflydelse på interneuronmigration. Den nye opsætning af langdistance-analyse og co-kultur migration assay giver celle-fri plads i intervallet centimeter (~ 1-1,5 cm) for at tillade påvisning af langdistance migration. En oversigt over funktionerne i vores analyser i forhold til andre populære analyser er præsenteret i tabel 1. Kollektivt, de analyser, der er beskrevet her vil tjene som en platform for vurdering af “syge” periventrikulære endotelceller og interneuroner genereret fra iPSCs af hjernesygdomme som skizofreni, autisme eller epilepsi. Disse analyser kan også bruges til at bestemme, hvordan forskellige tilstande (f.eks. hæmmere, ligander, RNAi) påvirker cellemigrationen. Endelig kan disse analyser optimeres til andre celletyper til måling af langdistancemigrering, kemo-tiltrækning eller cellebaseret medieret migrering.

Protocol

1. Kultur og opbevaring af humane periventrikulære endotelceller Vedligehold humane periventrikulære endotelceller på kældermembranmatrixbelagte (se Tabel over materialer) 6-brøndspladeri periventrikelendotelcellemedium (E6-medium, der indeholder 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 og 5 μM GABA) ved 37 °C og 5% CO2. Skift medium hver alternativ dag. Tø kældermembranmatrix i 4 °C, og lav en 1:100 opløsning ved at fortynde den i koldt DMEM/F12-medium. Coat hver brønd …

Representative Results

Trinene til opsætning af et etgodt kulturskær inde i en 35 mm skål er vist i figur 1. Langdistance migration assay og co-kultur migration assay brugt en one-well indsætte til frø det ønskede antal celler i midten af en poly-L-ornithin /laminin belagt 35 mm fad. På dag 0 var cellerne til stede som et rektangulært plaster (figur 2A,C). I dag 0 billeder, dag 0 linje kunne nemt identificeres ved den skarpe ka…

Discussion

Her beskrev vi tre in vitro-analyser, der tilsammen giver en kvantitativ vurdering af humane periventrikulære endotelcellespecifikke egenskaber. Disse analyser vil være værdifulde i at få mekanistisk indsigt i samspillet mellem menneskelige periventrikel endotelceller med menneskelige interneuroner. Eksperimenter, der anvender ligander, inhibitorer eller celler med genspecifik knockdown eller overekspression, vil identificere eller validere molekylære afspillere, der formidler endotelcellestyret interneuronmigration…

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100