Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Resumo

Apresentamos três simples ensaios in vitro - o ensaio migratório de longa distância, o ensaio de migração de cocultura, e o ensaio de atração de quimioterapia - que avaliam coletivamente as funções das células-tronco humanas derivadas células endoteliais periventriculares e suas interação com interneurônios GABAergic.

Resumo

O papel da vasculatura cerebral no desenvolvimento do sistema nervoso e na etiquetação de distúrbios cerebrais está ganhando cada vez mais atenção. Nossos estudos recentes identificaram uma população especial de células vasculares, as células endoteliais periventriculares, que desempenham um papel crítico na migração e distribuição de interneurônios gabaergicos do cérebro anterior durante o desenvolvimento embrionário. Isso, juntamente com suas funções autônomas de células, alude a novos papéis de células endoteliais periventriculares na patologia de doenças neuropsiquiátricas como esquizofrenia, epilepsia e autismo. Aqui, descrevemos três ensaios in vitro diferentes que avaliam coletivamente as funções das células endoteliais periventriculares e sua interação com interneurônios gabaergicos. O uso desses ensaios, particularmente em um contexto humano, nos permitirá identificar a ligação entre células endoteliais periventriculares e distúrbios cerebrais. Esses ensaios são simples, de baixo custo e reprodutíveis, e podem ser facilmente adaptados a qualquer tipo de célula aderente.

Introdução

As células endoteliais formam o revestimento dos vasos sanguíneos e mediam funções importantes que incluem manutenção da permeabilidade da parede do vaso, regulação do fluxo sanguíneo, agregação de plaquetas e formação de novos vasos sanguíneos. No cérebro, as células endoteliais fazem parte de uma barreira cerebral-cérebro crítica que controla firmemente a troca de materiais entre o cérebro e a corrente sanguínea¹. Nossos estudos na última década identificaram novos papéis neurogênicos de células endoteliais cerebrais que têm implicações significativas para o desenvolvimento e comportamento cerebral^2,

Protocolo

1. Cultura e Armazenamento de Células Endoteliais Periventriculares Humanas

1. Mantenha células endoteliais periventriculares humanas na membrana do porão revestida saciada (ver Tabela de Materiais) placas de 6 poços em meio de células endoteliais periventriculares (médio E6 contendo 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 e 5 μM GABA) a 37 °C e 5% CO₂. Mude o meio todos os dias alternativos.
2. Descongele a matriz de membrana do porão em 4 °C, e faça uma solução de 1:100 diluindo-a em meio DMEM/F12 frio. Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de solução matricial. Incubar placas a 37 °C por pelo menos 1h antes do uso.
....

Resultados

Os passos para configurar uma inserção de cultura de um poço dentro de um prato de 35 mm são mostrados na Figura 1. Ensaio seleção de migração de longa distância e ensaio de migração de co-cultura usaram uma inserção de um poço para semear o número desejado de células no centro de uma antena poli-L-ornithine/laminin revestida de 35 mm. No dia 0, as células estavam presentes como um remendo retangular (Figura 2A,C.......

Discussão

Aqui, descrevemos três ensaios in vitro que, juntos, fornecem avaliação quantitativa de propriedades específicas de células endoteliculares periventriculares humanas. Esses ensaios serão valiosos para obter insights mecanicistas sobre a interação de células endoteliais periventriculares humanas com interneurônios humanos. Experimentos usando ligands, inibidores ou células com knockdown ou superexpressão específicas de genes identificarão ou validarão jogadores moleculares que mediam a migração interneurônio guiada por cé.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de dissociação Accutase	Millipore Sigma	SCR005	Solução de dissociação celular (para células endoteliais periventriculares, etapa 1.4)
Anticorpo anti-beta;-tubulina humana	Biolegend	802001
Anticorpo anti-CD31 humano Anticorpo	Millipore Sigma	CBL468
Anti-MAP2	Neurômica	CH22103
Anticorpo anti-ativo Caspase 3	Millipore Sigma	AB3623
Controle de células endoteliais humanas	Dinâmica Celular	R1022
Controle de células endoteliais Suplemento Médio	Dinâmica Celular	M1019
Frascos criogênicos	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF / 12 médio	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 médio	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectina	Thermofisher Scientific	33016-015
Recipiente de congelamento	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacitômetro	Sigma-Aldrich	Z359629
Neurônios GABAérgicos Humanos	Dinâmica Celular	R1013
Neurônios GABAérgicos Humanos meio de base	Dinâmica Celular	M1010
Neurônio GABAérgico Humano Suplemento neural	Dinâmica Celular	M1032
Laminina	Sigma	L2020
membrana de porão	Matrigel	Corning	356230
Montagem Medium	Vector laboratories	H-1200
poli-L-ornitina	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Solução de		dissociação celular 12563011 científica (para interneurônios GABAérgicos e células endoteliais, seções 3 e 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Componente do meio de células endoteliais humanas de controle Cultura de
silicone de 2 poços - Inserção	de silicone ibidi	80209
3 poços inserto de cultura	ibidi	80369
prato de 35 mm	Corning	430165
tubo cônico de 15 ml	Fisher Scientific	07-200-886
Solução de PFA a 4%	Fisher Scientific	AAJ19943K2
placa de cultura de tecidos de 6 poços	Fisher Scientific	14-832-11
Microscópio de contraste de fase invertida	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Microscópio fluorescente	Olympus	FSX-100

Matriz de de