Поколение in-Frame Джин Удаление мутантов в Pseudomonas aeruginosa и тестирование на викроменность затмения в простой модели мыши инфекции
Summary
Здесь мы описываем простой и воспроизводимый протокол мышиной модели инфекции для оценки затухания генетически модифицированных штаммов Pseudomonas aeruginosa по сравнению с Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) утвержденных Escherichia coli для коммерческого применения.
Abstract
Микроорганизмы генетически универсальны и разнообразны и стали основным источником многих коммерческих продуктов и биофармацевтических препаратов. Хотя некоторые из этих продуктов естественным образом производятся организмами, другие продукты требуют генной инженерии организма для увеличения урожайности продукции. Авирулентные штаммы кишечной палочки традиционно являются предпочтительными бактериальными видами для производства биофармацевтических препаратов; однако, некоторые продукты трудны для e. coli для того чтобы произвести. Таким образом, авиационные штаммы других видов бактерий могут служить полезной альтернативой для производства некоторых коммерческих продуктов. Pseudomonas aeruginosa является общей и хорошо изученной грам-негативной бактерией, которая может стать подходящей альтернативой кишечной палочке. Тем не менее, P. aeruginosa является оппортунистическим человеческим патогеном. Здесь мы подробно процедуры, которые могут быть использованы для генерации непатогенных штаммов P. aeruginosa через последовательные геномные удаления с помощью pEX100T-NotI плазмиды. Основным преимуществом этого метода является производство деформации без маркера. Этот метод может быть использован для создания высоко ослабленных штаммов P. aeruginosa для производства коммерческих продуктов или для разработки штаммов для других конкретных целей. Мы также описываем простую и воспроизводимую модель мыши бактериальной системной инфекции с помощью интраперитонеальной инъекции проверенных тестовых штаммов для проверки затухания генно-инженерного штамма по сравнению с одобренным FDA штаммом BL21 e. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa является оппортунистическим бактериальным патогеном, который может вызвать опасные для жизни заболевания у людей, особенно в ослабленном иммунитете. Патогенность P. aeruginosa обусловлена выражением многих факторов вирулентности, включая протеазы и липополисахарид, а также его способностью образовывать защитную биопленку1. Из-за своей способности производить вирулентность факторов и вызвать болезни у людей, используя P. aeruginosa, чтобы сделать коммерческие продукты представляет проблемы безопасности. Непатогенные штаммы кишечной палочки традиционно используются для биоинженерных медицинских и коммерческих продуктов для использования человеком. Тем не менее, некоторые продукты трудно для кишечной палочки, чтобы сделать, и многие из них упакованы в включение органов, что делает добычу трудоемкой. Инженерные бактериальные штаммы с возможностью делать и выделять конкретные продукты очень желательно, так как секреция, скорее всего, увеличит урожайность и облегчит процессы очистки. Таким образом, непатогенные штаммы других видов бактерий (например, виды, которые используют более секреционные пути) могут обеспечить полезную альтернативу кишечной палочке. Недавно мы сообщили о разработке штамма P. aeruginosa, PGN5, в котором патогенность и токсичность организма сильно ослаблены2. Важно отметить, что этот штамм по-прежнему производит большое количество полисахаридного альгината, коммерчески интересного компонента биопленки P. aeruginosa.
Штамм PGN5 был создан с помощью двухступенчатой процедуры аллелистического обмена с плазмидом pEX100T-NotI, чтобы последовательно удалить пять генов(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA), как известно, способствуют патогенности организма. pEX100T-NotI был создан путем изменения SmaI на место распознавания ферментов ограничения NotI в пределах участка многократного клонирования плазмидного pEX100T, который был разработан в лаборатории Герберта Швайзера3,4. Место распознавания фермента NotI является более редкой последовательностью ДНК по сравнению с SmaI и менее вероятно, чтобы присутствовать в последовательностях, клонированных, таким образом, это более удобно для целей клонирования. Плазмида несет гены, которые позволяют для выбора, в том числе ген бла, который кодирует й-лактамазы и придает устойчивость к карбенициллин, и b. subtilissacB ген, который придает чувствительность сахарозы (Рисунок 1A). Плазмида также несет в себе происхождение репликации(ори)совместимы с кишечной палочкой,и происхождение передачи(oriT), что позволяет плазмидпередачи от кишечной палочки к Псевдомонас видов через спряжение. Тем не менее, плазмида не имеет происхождения репликации совместимы с Pseudomonas, и, таким образом, не может размножаться в Псевдомонас видов (т.е., это вектор самоубийства Pseudomonas). Эти характеристики делают pEX100T-NotI идеальным для таргетирования генетических удаляний из хромосомы Pseudomonas. Шаги клонирования плазмида выполняются с помощью кишечной палочки, и резучная плазмида передается в Псевдомонас путем трансформации или спряжения. Затем, через гомологичные события рекомбинации и селективные шаги, целенаправленное удаление в кадре генерируется, без маркеров. Этот метод последовательного удалять геномные области от хромосомы P. aeruginosa смог быть использован для того чтобы произвести высоки ослабленные штаммы Pseudomonas, как PGN5, или конструировать напряжения для других специфических польз (например, напряжения deficient в эндонуклизировании для плазмидного размножения или strains defic.
На общую вирулентность штаммов бактерий влияют условия роста и фазы, во время которых мутации происходят часто. Таким образом, измерение безопасности генетически-инженерных штаммов может быть сложной задачей. Для оценки бактериальных изолятов для системной вирулентности, мы адаптировали ранее опубликованный протокол инфекции путем интраперитонеальной инъекции c57BL/6 мышей5. Мы изменили эту процедуру, чтобы использовать замороженные бактериальные запасы для инъекций, что позволило для точного дозирования и легкой проверки используемых штаммов. В этой модели, штамм кишечной палочки BL21, который был одобрен FDA для производства биофармацевтических препаратов, был использован в качестве стандарта безопасности контроля для определения относительного патогенеза штамма6,7,8. Основным преимуществом использования этого метода является то, что он воспроизводим и сводит к минимуму источники вариаций, так как заражение штаммов проверяются на количество бактериальных клеток, фенотип и генетические маркеры как до, так и после заражения. С помощью этих контролируемых шагов, количество животных требуется уменьшается. В этой модели, P. aeruginosa штаммов, которые приводят к C57BL/6 коэффициенты смертности, равные или меньше, чем E. coli BL21 при инъекциях интраперитоно может рассматриваться с ослабленным. Эта простая модель мыши инфекции также может быть использована для оценки ослабленной патогенности генетически модифицированных штаммов от других видов, используя FDA утвержденных E. coli штамма в качестве ссылки. Шаги 1-7 подробно поколения последовательных геномных делетций в P. aeruginosa (Рисунок 1) и шаги 8-12 подробно использование мыши модели для проверки патогенности штаммов P. aeruginosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Плазмида pEX100T-Not1 является эффективным посредником последовательных геномных делетций, которые свободны от маркеров и находятся в кадре. При инженерных бактериальных штаммах для ослабленной вирулентности удаление целых генных последовательностей, а не генерация точечных мутаций сни?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) гранты R44GM113545 и P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
Referências
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
