Eksperimentel tilgang til at undersøge Leptin signalering i carotis organer og dens virkninger på kontrol af vejrtrækning
Summary
Vores undersøgelse fokuserer på virkningerne af Leptin signalering i carotis krop (CB) på hypoksiske ventilatorisk respons (HVR). Vi udførte eksperimenter med» tab af funktion «, der målte Leptin-effekten på HVR, efter at der var blevet foretaget en» Gain of Function «-eksperimenter, som målte HVR efter overekspression af Leptin-receptoren i CB.
Abstract
En adipocyte-producerede hormon Leptin er en potent respiratorisk stimulerende, som kan spille en vigtig rolle i forsvaret respiratorisk funktion i fedme. Carotis-organerne (CB), et nøgle organ med perifer hypoxisk følsomhed, udtrykker den lange funktionelle isoform af Leptin-receptoren (LepRb), men leptinsignalering i kontrol af vejrtrækningen er ikke fuldt belyst. Vi undersøgte hypoksiske ventilatorisk respons (HVR) (1) i C57BL/6j mus før og efter Leptin infusion ved baseline og efter CB denervation; (2) i Leprb-mangel på fede DB/DB -mus ved baseline og efter leprb -overekspression i CBs. I C57BL/6J-mus blev Leptin forhøjet HVR, og virkningen af Leptin på HVR blev afskaffet ved CB denervation. I DB/DB -mus forstørrede leprb -EKSPRESSION i CB HVR. Derfor konkluderer vi, at Leptin virker i CB til at forstærke respons på hypoksi.
Introduction
En fedtcellerne produceret hormon Leptin handlinger i hypothalamus at undertrykke fødeindtagelse og øge stofskiftet. Undersøgelser udført i vores laboratorium1,2 og af andre investigatorer3,4 viste, at Leptin øger hypercapnic ventilatorisk respons (HVR) forebygge fedme hypoventilation i leptin mangelfuld fedme. Men, et flertal af overvægtige personer har høj plasma leptin niveauer og demonstrere resistens over for de metaboliske og respiratoriske virkninger af hormonet5,6,7,8. Resistens over for Leptin er multifaktoriel, men begrænset permeabilitet af blod-hjerne barrieren (BBB) til Leptin spiller en stor rolle. Vi foreslår, at Leptin virker under BBB i et nøgle organ af perifer hypoxisk følsomhed, carotis organer (CB), for at forsvare vejrtrækning i overvægtige individer. CBs udtrykker den lange funktionelle isoform af Leptin receptor, leprb, men cb’s rolle i respiratoriske virkninger af Leptin er ikke tilstrækkeligt belyst9,10.
Målet med vores metode var at undersøge effekten af Leptin signalering i CB på HVR. Vores rationale var at udføre (a) tab af funktions eksperimenter ved infusion af leptin i mus med intakte carotis-kroppe og denerverede carotis-kroppe efterfulgt af HVR-målinger; b) øgning af funktions eksperimenter i DB/DB -mus, der mangler leprb, hvor vi målte HVR ved baseline og efter ekspression af leprb udelukkende i CB. Fordelen ved vores teknikker var, at vi udførte alle vores eksperimenter i uhæmmet ubedøvet mus under søvn og vågenhed. Tidligere investigatorer enten udført deres eksperimenter under anæstesi9 eller ikke måle virkningerne af Leptin under søvn10. Desuden er vores undersøgelse den første til at udnytte en unik gevinst ved funktions tilgang med selektiv LepRb -ekspression i CB beskrevet ovenfor.
I den brede sammenhæng kan vores tilgang generaliseret til andre receptorer udtrykt i CB og deres rolle i hypoxisk følsomhed. Investigatorerne kan indgyde en ligand til en receptor af interesse og måle HVR ved baseline og efter CB denervation. Som en supplerende tilgang kan en receptor af interesse over udtrykkes i CB-og HVR-målinger kan udføres før og efter overekspression ved hjælp af vores teknologi, der er beskrevet i dette manuskript.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hovedfokus i vores undersøgelse var at undersøge respiratoriske virkninger af Leptin signalering i CB. Flere protokoller er blevet udviklet til at vurdere rollen af leptin i en mekanisk måde. For det første blev det specifikke bidrag fra CB til HVR analyseret ved omhyggelig kvantificering af HVR i løbet af de første 2 min. af hypoxisk eksponering. For det andet blev relevansen af CB i leptin-medieret op-regulering af kontrol med vejrtrækning undersøgt ved to komplementære tilgange. Hos lean Wild-type mus med lav…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1×1010 pfu/ml | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5×1010 pfu/ml |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3mg/ml |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1ul per hour, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
Referências
- O’donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
- Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
- Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
- Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
- Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
- Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
- Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
- Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
- Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
- Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
- Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
- Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
- Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
- Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
- Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
- Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
- Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
- Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
- Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
- Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
- Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).
