Approccio sperimentale per esaminare la segnalazione di Leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione
Summary
Il nostro studio si concentra sugli effetti della segnalazione della leptina nel corpo carotide (CB) sulla risposta di ventilazione ipossica (HVR). Abbiamo effettuato esperimenti di “perdita di funzione” che misurano l’effetto della leptina sull’HVR dopo la denervazione della CB e gli esperimenti di “guadagno di funzione” che misurano l’HVR dopo la sovraespressione del recettore della leptina nel CB.
Abstract
Un ormone prodotto da adipociti leptina è un potente stimolante respiratorio, che può svolgere un ruolo importante nella difesa della funzione respiratoria nell’obesità. I corpi carotidi (CB), un organo chiave di sensibilità ipossica periferica, esprimono la lunga isoformazione funzionale del recettore leptina (LepRb), ma il ruolo della segnalazione della leptina nel controllo della respirazione non è stato completamente chiarito. Abbiamo esaminato la risposta di ventilazione ipossica (HVR) (1) nei topi C57BL/6J prima e dopo l’infusione di leptina al basale e dopo la denervazione CB; (2) in mouse LepRb-deficienti db/db obesi al basale e dopo la sovraespressione LepRb in CB. Nei topi C57BL/6J, la leptina ha aumentato l’HVR e gli effetti della leptina sull’HVR sono stati aboliti dalla denervazione della CB. Nei mouse db/db, l’espressione LepRb in CB ha aumentato l’HVR. Pertanto, concludiamo che la leptina agisce in CB per aumentare le risposte all’ipossia.
Introduction
Un adipocito prodotto ormone leptina agisce nell’ipotalamo per sopprimere l’assunzione di cibo e aumentare il tasso metabolico. Studi condotti nel nostro laboratorio1,2 e da altri ricercatori3,4 hanno mostrato che la leptina aumenta la risposta ventilatoria ipercapnica (HVR) prevenendo l’ipoventilazione dell’obesità nella leptina obesità carente. Tuttavia, la maggior parte degli individui obesi hanno alti livelli di leptina plasmatica e dimostrano resistenza agli effetti metabolici e respiratori dell’ormone5,6,7,8. La resistenza alla leptina è multifattoriale, ma la permeabilità limitata della barriera emato-encefalica (BBB) alla leptina svolge un ruolo importante. Proponiamo che la leptina agisca al di sotto della BBB in un organo chiave di sensibilità ipossica periferica, i corpi carotidi (CB), per difendere la respirazione in individui obesi. Le CB esprimono la lunga isoformazione funzionale del recettore della lepina, LepRb, ma il ruolo della CB negli effetti respiratori della leptina non è stato sufficientemente chiarito9,10.
L’obiettivo del nostro metodo era quello di esaminare l’effetto della segnalazione di leptina nel CB sull’HVR. La nostra logica era quella di eseguire (a) esperimenti di perdita di funzione infondendo leptina nei topi con corpi carotidi intatti e corpi carotidi denervati seguiti da misurazioni HVR; (b) guadagno di esperimenti di funzione in topi db/db privi di LepRb, in cui abbiamo misurato l’HVR al basale e dopo l’espressione di LepRb esclusivamente in CB. Il vantaggio delle nostre tecniche era che abbiamo eseguito tutti i nostri esperimenti su topi non adeguatamente svincolati durante la sonnoenza e la veglia. I ricercatori precedenti hanno eseguito i loro esperimenti in anestesia9 o non hanno misurato gli effetti della leptina durante il sonno10. Inoltre, il nostro studio è il primo a utilizzare un approccio unico di guadagno di funzione con espressione LepRb selettiva in CB descritto sopra.
In generale, il nostro approccio può essere generalizzato ad altri recettori espressi in CB e il loro ruolo nella sensibilità ipossica. I ricercatori possono infondere un ligando a un recettore di interesse e misurare l’HVR al basale e dopo la denervazione CB. Come approccio complementare, un recettore di interesse può essere sovraespresso nelle misurazioni CB e HVR può essere eseguito prima e dopo la sovraespressione utilizzando la nostra tecnologia descritta in questo manoscritto.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo principale del nostro studio è stato quello di esaminare gli effetti respiratori della segnalazione della leptina nel CB. Diversi protocolli sono stati sviluppati per valutare il ruolo della leptina in modo meccanicistico. In primo luogo, il contributo specifico di CB all’HVR è stato analizzato da un’attenta quantificazione dell’HVR durante i primi 2 min di esposizione ipossica. In secondo luogo, la rilevanza della CB nell’up-regolazione del controllo della respirazione mediata dalla leptina è stata esamin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| 1ml Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1×1010 pfu/ml | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5×1010 pfu/ml |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3mg/ml |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1ul per hour, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
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